Phần 3 Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1. Thiết kế thí nghiệm
3.4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng saccarozo/cao nấm men, tỉ lệ giống cấy, lưu lượng sục khí, thời gian nuôi giống đến sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm Địa sâm trong giai đoạn nhân giống cấp 2 dịch thể
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng saccarozo đến sinh trưởng hệ sợi nấm Địa sâm trong giai đoạn nhân giống cấp 2 dịch thể 200ml
Nhằm xác định đƣợc hàm lƣợng saccarozo thích hợp nhất cho sự sinh trƣởng phát triển của nấm Địa sâm, tác giả tiến hành bố trí thí nghiệm nghiên cứu các công thức nhƣ sau: CT 1: 10g saccarozo + 5g CNM+ 0,5 g/l MgSO4.7H2O và 1,0g/l KH2PO4 CT 2: 15g saccarozo + 5g CNM+ 0,5 g/l MgSO4.7H2O và 1,0g/l KH2PO4 CT 3: 20g saccarozo + 5g CNM + 0,5 g/l MgSO4.7H2O và 1,0g/l KH2PO4 CT 4: 25g saccarozo + 5g CNM + 0,5 g/l MgSO4.7H2O và 1,0g/l KH2PO4 CT 5: 30g saccarozo + 5g CNM + 0,5 g/l MgSO4.7H2O và 1,0g/l KH2PO4 Theo dõi xác định sinh khối sợi và mật độ khuẩn lạc cầu.
Các yếu tố phi thí nghiệm:
+ Tỷ lệ giống cấy: 10ml dịch giống cấy cấp 1 + Chế độ lắc: 150 vòng/phút, pH=7,0
+ Chế độ nuôi sợi:
Thời gian nuôi giống 4 ngày.
Nhiệt độ: 25±1oC.
Chế độ ánh sáng: Không cần ánh sáng.
Độ ẩm không khí: 65 - 70%. Thời gian tiến hành thí nghiệm: tháng 4/2017
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sinh trưởng của sợi nấm Địa sâm trong giai đoạn nhân giống cấp 2 trung gian dạng dịch thể 2000ml
Trong thí nghiệm này, tác giả sử dụng nguồn giống cấp 2 dịch thể 200ml để cấy vào bình Duran (5000ml) mỗi bình chứa 2000ml dịch. Lƣợng giống cấy vào bình gồm 5 công thức khác nhau, tỉ lệ thể tích so với môi trƣờng nhân nuôi.
CT1: 3% (60ml) CT2: 5% (100ml)
CT3: 7% (140ml)
CT4: 10% (200ml) CT5: 15% (300ml)
Các yếu tố phi thí nghiệm:
+ Giống cấp 2 dịch thể: đƣợc xác định ở thí nghiệm 1 + Tốc độ sục khí: 0,7V/V/M
+ Thời gian nuôi: 4 ngày + Chế độ nuôi sợi:
Nhiệt độ: 25±1oC.
Chế độ ánh sáng: Không cần ánh sáng.
Độ ẩm không khí: 65 - 70% Thời gian tiến hành thí nghiệm: tháng 4/2017
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của lưu lượng sục khí đến sinh trưởng
hệ sợi nấm Địa sâm trong giai đoạn nhân giống cấp 2 trung gian dạng dịch thể
2000ml
Tiến hành thí nghiệm với 5 mức sục khí khác nhau:
CT1: 0,4V/V/M CT3: 0,6V/V/M CT5: 0,8V/V/M
CT2: 0,5V/V/M CT4: 0,7V/V/M
Ghi chú: V/V/M (lít không khí/lít môi trƣờng/phút)
Các yếu tố phi thí nghiệm:
+ Môi trƣờng nhân giống: đƣợc xác định ở thí nghiệm 1 + Tỷ lệ giống cấy: tỉ lệ cấy giống xác định ở thí nghiệm 2 + Chế độ nuôi sợi:
Thời gian nuôi giống 4 ngày.
Nhiệt độ: 25±1oC.
Chế độ ánh sáng: Không cần ánh sáng.
Độ ẩm không khí: 65 - 70%. Thời gian tiến hành thí nghiệm: tháng 5/2017
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi giống đến sinh trưởng hệ sợi nấm Địa sâm trong giai đoạn nhân giống cấp 2 dịch thể
Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành nuôi giống nấm Địa sâm với các khoảng thời gian khác nhau:
CT1: sau nuôi 2 ngày CT3: sau nuôi 4 ngày CT5: sau nuôi 6 ngày CT2: sau nuôi 3 ngày CT4: sau nuôi 5 ngày
Theo dõi chu kỳ sinh trƣởng hệ sợi nấm trong môi trƣờng dịch để xác định thời điểm cấy giống tốt nhất.
Các yếu tố phi thí nghiệm:
+ Môi trƣờng nhân giống: đƣợc xác định ở thí nghiệm 1 + Tỷ lệ giống cấy: xác định ở thí nghiệm 2
+ Tốc độ sục khí: xác định ở thí nghiệm 3 + Chế độ nuôi sợi:
Nhiệt độ: 25±1oC.
Chế độ ánh sáng: Không cần ánh sáng.
Độ ẩm không khí: 65 - 70%. Thời gian tiến hành thí nghiệm: tháng 5/2017
3.4.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của loại giá thể, độ ẩm cơ chất, nhiệt độ không khí, độ ẩm không khí, loại đất phủ đến sinh trưởng phát triển nấm Địa sâm trong giai đoạn nuôi trồng
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại cơ chất phối trộn đến sinh trưởng phát triển nấm Địa sâm trong giai đoạn nuôi trồng
Giống nấm Địa sâm đƣợc nuôi trồng trong các môi trƣờng cơ chất phối trộn theo bảng sau:
Bảng 3.2. Thành phần giá thể nuôi trồng nấm Địa Sâm
Đơn vị tính: % theo khối lƣợng
Nguyên liệu (%) Công thức Lõi ngô Rơm Mùn cƣa Bông Cám ngô Cám gạo CaCO3 1 45 - - 44 5 5 1 2 - - 44 45 5 5 1 3 - 89 - - 5 5 1 4 45 - 44 - 5 5 1
Các yếu tố phi thí nghiệm:
+ Giống cấp 2 dịch thể: đƣợc xác định ở thí nghiệm 1,2,3,4 + Lƣợng giống cấy: 30ml/bịch
+ Khối lƣợng bịch nguyên liệu: 1,6kg + Chế độ nuôi sợi: Nhiệt độ: 25±1oC. Chế độ ánh sáng: Không cần ánh sáng. Độ ẩm không khí: 65 - 70%. + Chế độ ra quả thể: Nhiệt độ: 18±20C Chế độ ánh sáng: 500lux Độ ẩm không khí: 85±2%
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất đến sinh trưởng phát triển nấm Địa sâm trong giai đoạn nuôi trồng
Trong giai đoạn nuôi trồng chúng tôi đã tiến hành đánh giá 3 mức độ ẩm nguyên liệu khác nhau:
CT2: 65% ± 2 CT3: 75% ± 2 Các yếu tố phi thí nghiệm:
+ Giống cấp 2 dịch thể: đƣợc xác định ở thí nghiệm 1,2,3,4 + Lƣợng giống cấy: 30ml/bịch
+ Cơ chất nuôi trồng: đƣợc xác định ở thí nghiệm 5 +Khối lƣợng bịch nguyên liệu: 1,6kg
+ Chế độ nuôi sợi: Nhiệt độ: 25±1oC. Chế độ ánh sáng: Không cần ánh sáng. Độ ẩm không khí: 65 - 70%. + Chế độ ra quả thể: Nhiệt độ: 18±20C Chế độ ánh sáng: 500lux Độ ẩm không khí: 85±2%
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sinh trưởng phát triển nấm Địa sâm trong giai đoạn nuôi trồng
Sau khi sợi nấm ăn kín bịch nguyên liệu, chúng tôi tiến hành theo dõi sự hình thành mầm quả thể và năng suất nấm tƣơi ở 04 ngƣỡng nhiệt độ khác nhau:
CT1 = 14 ± 20C CT3 = 24 ± 20C CT2 = 18 ± 20C CT4 = 28 ± 20C Các yếu tố phi thí nghiệm:
+ Bịch nguyên liệu đƣợc đặt trong phòng có điều hoà nhiệt độ. + Giống cấp 2 dịch thể: đƣợc xác định ở thí nghiệm 1,2,3,4 + Lƣợng giống cấy: 30ml/bịch
+ Cơ chất nuôi trồng: đƣợc xác định ở thí nghiệm 5 + Ẩm độ cơ chất: đƣợc xác định ở thí nghiệm 6
+ Khối lƣợng bịch nguyên liệu: 1,6kg + Chế độ nuôi sợi: Nhiệt độ: 25±1oC. Chế độ ánh sáng: Không cần ánh sáng. Độ ẩm không khí: 65 - 70%. + Chế độ ra quả thể: Chế độ ánh sáng: 500lux Ẩm độ không khí: 85 ± 2%
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm không khí đến sinh trưởng phát triển nấm Địa sâm trong giai đoạn nuôi trồng
Để đánh giá ảnh hƣởng của độ ẩm môi trƣờng xung quanh trong giai đoạn hình thành và phát triển quả thể chúng tôi tiến hành thí nghiệm nuôi trồng nấm Địa sâm trong các điều kiện độ ẩm không khí khác nhau.
CT1: 65 ± 3% CT 2: 75 ± 3% CT 3: 85 ± 3% Các yếu tố phi thí nghiệm:
+ Các bịch nguyên liệu đƣợc đặt trong phòng có máy điều chỉnh ẩm độ. + Giống cấp 2 dịch thể: đƣợc xác định ở thí nghiệm 1,2,3,4
+ Lƣợng giống cấy: 30ml/bịch
+ Cơ chất nuôi trồng: đƣợc xác định ở thí nghiệm 5 + Ẩm độ cơ chất: đƣợc xác định ở thí nghiệm 6 +Khối lƣợng bịch nguyên liệu: 1,6kg
+ Chế độ nuôi sợi: Nhiệt độ: 25±1oC. Chế độ ánh sáng: Không cần ánh sáng. Độ ẩm không khí: 65 - 70%. + Chế độ ra quả thể:
Chế độ ánh sáng: 500lux
Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của thành phần vật liệu phủ tới thời gian hình thành quả thể và năng suất nấm Địa sâm
Sau khi hệ sợi ăn kín bịch nguyên liệu, tiến hành phủ bịch với tỉ lệ khác nhau. Tỉ lệ thành phần vật liệu phủ tính theo thể tích.
CT1: 100% thịt nhẹ
CT2: 25% trấu hun + 75% đất thịt nhẹ CT3: 50% trấu hun + 50% đất thịt nhẹ CT4: 75% trấu hun + 25% đất thịt nhẹ
CT5: 100% trấu hun + 1 lớp đất thịt nhẹ mỏng
Các yếu tố phi thí nghiệm:
+ Cơ chất nuôi trồng: đƣợc xác định ở thí nghiệm 5 + Khối lƣợng bịch nguyên liệu: 1,6kg
+ Độ dày lớp phủ 2,5 - 3,0cm, pH= 7,0 - 7,5. + Chế độ ra quả thể: Nhiệt độ: đƣợc xác định ở thí nghiệm 7 Chế độ ánh sáng: 500lux Ẩm độ không khí: Xác định ở thí nghiệm 8 3.4.2. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên (RCB) với 3 lần nhắc lại.
+ Thí nghiệm nhân giống cấp 2:
Thí nghiệm về hàm lƣợng Saccarozo: bố trí 30 chai giống/công thức/lần nhắc lại. Thí nghiệm về lƣu lƣợng sục khí, thời gian nuôi: Bố trí 10 bình Duran (5000ml) mỗi bình chứa 2000ml/công thức/lần nhắc lại.
+ Thí nghiệm nuôi trồng: Mỗi công thức thí nghiệm đƣợc bố trí 50 bịch nguyên liệu/công thức/lần nhắc lại.
3.4.3. Các chỉ tiêu theo dõi
3.4.3.1. Theo dõi sinh trưởng phát triển của nấm Địa sâm trong giai đoạn nhân giống dịch thể
- Khuẩn lạc cầu (pellets): Là một dạng của sản phẩm lên men hệ sợi nấm trong môi trƣờng dịch thể. Là kết quả của sự xoắn cuộn, liên kết hệ sợi lại với nhau tạo thành hạt có dạng hình cầu (Nguyễn Thị bích Thùy, 2014).
- Mật độ khuẩn lạc cầu: Là số khuẩn lạc cầu (KLC) có trong 10 ml dịch giống (Nguyễn Thị bích Thùy, 2014) và đƣợc xếp hạng nhƣ sau:
+: Số lượng KLC từ 10 – 30 KLC/10ml ++: Số lượng KLC từ 31 – 60 KLC/10ml +++: Số lượng KLC từ 61 – 90 KLC/10ml ++++: Số lượng KLC từ 91 – 120 KLC/10ml
- Đƣờng kính khuẩn lạc cầu: Sử dụng kính hiển vi Optika để xác định đƣờng kính khuẩn lạc cầu. Đơn vị tính: mm
- Sinh khối sợi: Xác định sinh khối theo phƣơng pháp của Park et al. (2001), mẫu đƣợc ly tâm ở 12000v trong 15 phút, lọc bằng màng milipore 0,45µm. Mẫu đƣợc rửa 4 lần với ethanol bão hòa, bảo quản qua đêm ở 40
C. Khối lƣợng sợi khô đƣợc xác định sau khi rửa khuẩn lạc cầu với nƣớc cất và sấy ở 700C qua đêm đến khối lƣợng không đổi. Kết thúc quá trình nuôi sợi, ly tâm dịch giống, cân khối lƣợng hệ sợi thu đƣợc. Đơn vị tính: g/l dịch giống.
3.4.3.2. Theo dõi sinh trưởng phát triển của nâm Địa sâm trong giai đoạn nuôi trồng
Tốc độ phát triển hệ sợi: Là số đơn vị chiều dài hệ sợi nấm phát triển trên giá thể nuôi trồng. Đơn vị: mm/ngày
Đặc điểm hệ sợi: Quan sát đặc điểm hệ sợi của mỗi công thức nghiên cứu và đánh giá độ dày hệ sợi bằng phƣơng pháp của Karidi et al., (1998) gồm các mức:
+) mật độ hệ sợi rất thƣa 4+) mật độ hệ sợi dày 2+) mật độ hệ sợi thƣa 5+) mật độ hệ sợi dày đặc 3+) mật độ hệ sợi trung bình
Thời gian hệ sợi phát triển kín giá thể: Là thời gian đƣợc tính từ khi cấy giống đến khi hệ sợi nấm phát triển kín bịch giá thể. Đơn vị tính: Ngày
Thời gian hình thành quả thể nấm: Là thời gian đƣợc tính từ khi bắt đầu cấy giống đến khi hệ sợi nấm bắt đầu hình thành mầm quả thể. Đơn vị tính: Ngày
Thời gian quả thể trƣởng thành: Là thời gian đƣợc tính từ khi bắt đầu cấy giống. Đơn vị tính: Ngày
Khối lƣợng quả thể nấm: g/quả
Tốc độ phát triển hệ sợi (mm/ngày) =
Tỷ lệ nhiễm (%) =
Tỷ lệ mầm hữu hiệu (%) =
Hiệu suất sử dụng cơ chất(%) =
3.5. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm thống kê Excel 2007 và IRRISTAT 5.0
3.6. QUY TRÌNH CHUẨN BỊ THÍ NGHIỆM
3.6.1. Nhân giống cấp 2 nấm Địa sâm Coprinus comatus dạng dịch thể
3.6.1.1. Chuẩn bị môi trường
Cao nấm men, đƣờng sucrose, các hóa chất khác đƣợc hòa tan vào nƣớc. Bổ sung nƣớc cất cho đủ 1000 ml, sử dụng hóa chất NaOH 1M và HCl 1M điều chỉnh pH dung dịch.
Dung dịch vừa pha chế đƣợc đổ vào bình thủy tinh thể tích 5000 ml, mỗi bình chứa 2000ml và các chai 500ml mỗi chai chứa 200ml dịch môi trƣờng, khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 60 phút.
3.6.1.2. Chuẩn bị dịch giống cấp 2 (200ml)
Hệ sợi của ống giống cấp 1 dạng thạch đúng tuổi(12 ngày tuổi) đƣợc lấy toàn bộ vào 200 ml thể tích dung dịch đã đƣợc hấp khử trùng ở 121oC trong thời
gian 60 phút. Sử dụng máy nghiền để làm nhỏ hệ sợi nấm tạo thành một dung dịch giống. Các chai dịch sau khi cấy giống đƣợc nuôi trên máy lắc Seriker II - Hàn quốc trong 4 ngày.
3.6.1.3. Cấy giống
Sử dụng giống cấp 2 (200ml) nấm Địa sâm 4 ngày tuổi để cấy chuyển. Sau khi khử trùng, bình dịch môi trƣờng đƣợc bảo quản trong phòng cấy sạch, khi nhiệt độ dung dịch nhỏ hơn 30oC thì tiến hành cấy giống. Giống đƣợc cấy trong box cấy sinh học, đảm bảo điều kiện vô trùng, hạn chế và giảm tỉ lệ nhiễm. Tỉ lệ giống cấy là 30%.
3.6.1.4. Nuôi sợi
Các bình dịch sau khi cấy giống đƣợc nuôi cấy tùy thuộc vào từng thí nghiệm, các yếu tố phi thí nghiệm sau đƣợc sử dụng kết quả tối ƣu nhất của thí nghiệm đã nghiên cứu ở giai đoạn trƣớc.
3.6.2. Nuôi trồng nấm Địa sâm Coprinus comatus 3.6.2.1. Chuẩn bị môi trường 3.6.2.1. Chuẩn bị môi trường
Các nguồn cơ chất, cám ngô, cám gạo, bột nhẹ, túi nilon PE, cổ nắp và chun buộc.
3.6.2.2. Hấp khử trùng
Môi trƣờng có thể đƣợc hấp khử trùng ở 2 chế độ: Nồi hấp điện tử ở 121oC, 1atm trong thời gian 180 phút Nồi thủ công 1000C trong 6h.
3.6.2.3. Cấy giống
Môi trƣờng khử trùng đƣợc để nguội rồi tiến hành cấy giống. Loại giống: Giống Địa sâm cấp 2 dạng dịch thể.
Tỷ lệ giống cấy theo thí nghiệm nghiên cứu.
3.6.2.4. Nuôi sợi
Giống nấm sau khi cấy đƣợc ƣơm sợi trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng đƣợc bố trí theo theo từng thí nghiệm nghiên cứu, độ ẩm không khí 65 - 70%.
3.6.2.5. Vật liệu phủ và cách phủ
Nấm Địa sâm là loại nấm chỉ có thể hình thành quả thể bằng phƣơng pháp phủ trên bề mặt mới có nấm mọc. Vật liệu phủ đƣợc sử dụng là đất thịt nhẹ giàu dinh dƣỡng hữu cơ (đƣợc lấy từ tầng canh tác lúa hoặc rau màu) và trấu hun. pH vật liệu phủ thích hợp là 7,0- 7,5. Trấu hun đã qua xử lý nấm bệnh có thể mua tại các cơ sở chuyên cung cấp giá thể sạch trồng cây, trồng rau. Đất ruộng sau khi lấy về tiến hành đập nhỏ, lấy sàng có lan thƣa lắc nhẹ loại bỏ đất bột, vụn. Đƣờng kính viên đất 0,3-1,5cm đem phơi thật khô và sử dụng.
Trƣớc khi phủ cần kiểm tra xem sợi nấm mọc đều trên mặt và ăn sâu vào cơ chất có màu trắng bạc nhƣ tàn thuốc lá là đủ điều kiện phủ đất. Nếu mặt luống khô, tƣới nhẹ cho ẩm đều. Đổ nhẹ vật liệu lên mặt, dùng tay hoặc bàn gạt san đều vật liệu có chiều dày 2,5-3cm. Sau khi phủ đất xong trong khoảng 3-4 ngày đầu dùng bình phun nhiều lần sao cho đủ ẩm toàn bộ lớp vật liệu phủ, với đất phủ cần kiểm tra độ ẩm bằng cách bẻ viên đất không còn lõi trắng là đạt yêu cầu. Các ngày tiếp theo giảm lƣợng nƣớc tƣới, duy trì ẩm độ liên tục nhƣ đất gieo hạt rau khoảng 80-85% cho tới khi nấm mọc.
3.6.2.6. Chăm sóc
Sau cấy giống, khi hệ sợi phát triển kín toàn bộ cơ chất cũng là lúc hệ sợi nấm bắt đầu chuyển sang giai đoạn sinh trƣởng sinh thực. Lúc này bắt đầu điều chỉnh các điều kiện chăm sóc phù hợp với các thí nghiệm đã đƣợc bố trí. Các yếu tố phi thí nghiệm sau sẽ ứng dụng kết quả tối ƣu nhất của các yếu tố thí nghiệm đã đƣợc nghiên cứu ở thí nghiệm trƣớc.
Nấm Địa sâm nếu đƣợc nuôi trồng ở ngoài trời mọc quả thể rất phụ thuộc vào