Nƣớc ta nghề trồng nấm đƣợc bắt đầu từ những năm 80 của thế kỷ 19. Hiện nay, Việt nam đang phát triển 10-12 loại Nấm chủ lực đó là: nấm rơm, mộc nhĩ, nấm hƣơng, nấm mỡ, nấm sò, nấm dƣợc liệu (Linh chi ,Vân chi, Đầu khỉ)… Với những thuận lợi về điều kiện tự nhiên, nguồn nguyên vật liệu, nghề trồng nấm ở nƣớc ta đã đạt đƣợc nhiều kết quả khả quan. Tổng sản lƣợng nấm tăng bình quân qua các năm khoảng 7 - 10%/năm, cao nhất năm 2011 đạt 21,9 nghìn tấn, năm 2012 giảm xuống còn 20 nghìn tấn và năm 2013 có xu hƣớng phát triển trở lại với tổng sản lƣợng đạt 21 nghìn tấn (FAO, 2015).
Về thị trƣờng, trong những mặt hàng rau xuất khẩu năm 2009 thì kim ngạch xuất khẩu nấm luôn đạt cao nhất. Theo số liệu thống kê của Tổng cục Hải quan, kim ngạch xuất khẩu nấm 11 tháng năm 2009 đạt 17 triệu USD, tăng 26,7% so với cùng kỳ 2008. Có 31 thị trƣờng nhập khẩu nấm của Việt Nam, trong đó thị trƣờng Hoa Kỳ đạt kim ngạch cao nhất với 7,7 triệu USD, tăng 29,7% so với cùng kỳ 2008.
2.6.2.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống nấm dịch thể ở Việt Nam
Nƣớc ta bắt đầu sản xuất nấm từ những năm 80 của thế kỷ 19, nhƣng việc tiếp cận các công nghệ sản xuất tiên tiến, hiện đại của ngành nấm nƣớc ta còn rất nhiều hạn chế. Nghiên cứu và sản xuất nấm bằng công nghệ dịch thể với những ƣu điểm vốn có đã và đang đƣợc thế giới phát triển mạnh. Tuy nhiên vấn đề này ở Việt Nam còn khá mới mẻ và mới chỉ dừng lại ở việc nghiên cứu thành phần môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho một số loại nấm nhất định.
Lê Thị Hoàng Yến và cs.(2003) đã thử nghiệm nhân giống nấm Vân Chi
(Trametes versicolo) trên môi trƣờng dịch thể cho kết quả thu đƣợc nấm Vân Chi sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng 20g bột đậu tƣợng: 20g saccarose: 2,5g (NH4)2SO4: 2g CaCO3: 1g MgSO4; sinh khối sợi 16,68 g/lít.
Vũ Thị Hằng (2012) nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ nhân giống nấm Kim châm Flammulina velutipes dạng dịch thể. Kết quả bƣớc đầu cho thấy nấm
Kim châm Flammulina velutipes sinh trƣởng tốt nhất trong môi trƣờng có chứa 1g/l pepton+ 2g/l cao nấm men + 0,5g/l MgSO4.7H2O + 150 g/l nấm sò tƣơi + 20 g/l cám ngô + 20 g/l glucose, nhiệt độ nuôi giống 22±1oC, tốc độ lắc 140 vòng/phút, thời gian nuôi giống từ 5 - 7 ngày.
Nguyễn Thị Bích Thùy (2014) nghiên cứu công nghệ nhân giống nấm Sò Vua
(Pleurotus eryngii) và nấm Vân Chi (Tremates versicolo) dạng dịch thể. Kết quả đã xác định điều kiện tối ƣu để nhân giống cấp 1 dạng dịch thể cho 2 loại nấm này. Nấm Sò Vua (Pleurotus eryngii) thích hợp với môi trƣờng nhân giống 2,5 gam Cao nấm men + 2,5 gam pepton + 0,5 gam MgSO4. 7H2O + 1 gam KH2PO4 + 100 gam nấm tƣơi + 15 gam đƣờng glucose, chế độ lắc 160 vòng/phút, tỷ lệ giống gốc sử dụng là 30% ống giống gốc/200ml môi trƣờng, thời gian nuôi là 96 giờ. Giống nấm Vân Chi thích hợp với môi trƣờng nhân giống 2 gam cao nấm men + 0,2 gam MgSO4.7H2O + 1 gam KH2PO4 + 1,5 mg Thiamin + 15 gam đƣờng glucose, chế độ lắc 140 vòng/phút, tỷ lệ giống gốc 30%, thời gian nuôi giống 84 giờ.
Dự án sản xuất thử nghiệm nấm Ngọc Châm (Hypsizigus mamoreus) và nấm Chân Dài (Clytocybe maxima) theo quy mô công nghiệp giai đoạn từ 2012 đến 2014 do Trung tâm Công nghệ sinh học thực vật thực hiện đã nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống cấp 1, cấp 2 (cấp trung gian) và quy trình nuôi trồng nấm Ngọc Châm và nấm Chân Dài dạng dịch thể. Dự án đã xác định đƣợc điều kiện thích hợp để nhân giống nấm Ngọc Châm và nấm Chân Dài dạng dịch thể.
Song song với dự án sản xuất thử nghiệm, năm 2012 - năm 2014, Trung tâm Công nghệ sinh học thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp thực hiện đề tài Nghiên cứu công nghệ nhân giống dịch thể nấm ăn và nấm dƣợc liệu. Đề tài đã xây dựng công nghệ nhân giống nấm dạng dịch thể từ cấp 200 ml đến 5000 ml và công nghệ nhân giống nấm dịch thể trong hệ thống nồi lên mem với thể tích 120 lít cho đối tƣợng là 7 loại nấm ăn và nấm dƣợc liệu khác nhau.
Ở Việt Nam cho đến nay, chƣa có công bố khoa học chính thức nào về việc tự chủ công nghệ nhân giống dịch thể nấm Địa sâm. Do đó, nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát triển hệ sợi nấm Địa sâm trong môi trƣờng nhân giống dịch thể có ý nghĩa thiết thực cao.
2.6.2.2. Tình hình nghiên cứu nuôi trồng nấm Địa sâm ở Việt Nam
Nấm Địa sâm cho đến nay vẫn là một loại nấm mới của việt Nam, nhân giống và nuôi trồng nấm Địa sâm chỉ đang dừng lại ở các công trình nghiên cứu quy mô phòng thí nghiệm. Việc sản xuất nấm Địa sâm với mục địch thƣơng mại hầu nhƣ chƣa có ở nƣớc ta.
Theo Trịnh Tam Kiệt (2013) nấm Địa sâm có thể nuôi trồng trong nhà hoặc ngoài trời trên cơ chất thô hoặc chín, trên luống đất, trên sàn hoặc trên túi. Nguyên liệu nuôi trồng nấm Địa sâm gồm vỏ hạt bông, bã mía…cơ chất nuôi trồng và đất phủ có pH = 7. Hàm lƣợng nƣớc trong cơ chất 60%. Thời vụ nuôi trồng nấm Địa sâm ở nƣớc ta từ tháng 9 đến tháng 5 năm sau. Nhiệt độ thích hợp cho quả thể phát triển là 12-180C, độ ẩm tƣơng đối giai đoạn này 90%.
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu là nấm Địa sâm (Coprinus comatus)
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
3.1.2.1. Nguồn giống
+ Giống gốc nấm Địa sâm là giống nấm mới đƣợc Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển nấm - Viện Di truyền Nông nghiệp nhập nội từ Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển nấm ăn châu Á Thái Bình Dƣơng - Phúc Kiến - Trung Quốc.
+ Giống cấp 1 nấm Địa sâm: Là giống đƣợc nhân chuyển từ giống gốc Địa sâm trên môi trƣờng YEPD (20g gluco + 10g cao nấm men (CNM) + 20g peptone + 15g agar).
+ Giống cấp 2 nấm Địa sâm dạng dịch thể: Là giống đƣợc nhân chuyển từ giống 1 cấp Địa sâm trên môi trƣờng dịch thể (20g saccarozo + 5g CNM + 0,5g MgSO4.7H2O + 1g KH2PO4)/lít.
3.1.2.2. Hóa chất
Đƣờng glucozo, đƣờng saccarozo, cao nấm men, pepton, MgSO4.7H2O, KH2PO4, HCl, NaOH, NaNO3, NH4NO3…xuất xứ từ công ty Merck - Đức.
3.1.2.3. Nguyên liệu
+ Thạch aga, cám ngô, cám gạo... + Mùn cƣa, bông hạt, rơm rạ.. + Bột nhẹ và một số phụ gia khác...
3.2.2.4. Dụng cụ và thiết bị
- Box cấy sinh học, que cấy, dao cấy, bình tam giác, đĩa petri, giấy bạc,… - Máy li tâm.
- Tủ bảo ôn Evermed và Yanmar. - Bình tam giác 500 ml.
- Máy khuấy từ.
- Máy nghiền mẫu Homogenizer vo5-Đức.
- Kính hiển vi Optika soi sợi và chụp ảnh, kết nối với máy tính đã cài đặt phần mềm chuyên dụng.
- Máy đo pH, máy đo độ ẩm - nhiệt độ phòng, máy đo cƣờng độ CO2 và máy đo cƣờng độ chiếu sáng.
- Nồi hấp khử trùng.
- Phòng nuôi giống có điều hòa nhiệt độ 2 chiều và quạt thông gió.
- Nhà nuôi trồng có lắp máy lạnh, có khả năng điều chỉnh nhiệt độ; hệ thống thông gió và tƣới phun sƣơng tự động; hệ thống đèn led chiếu sáng, có khả năng điều chỉnh thời gian và cƣờng độ chiếu sáng.
3.2. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
Phòng nghiên cứu và Trạm Thực nghiệm nấm Văn Giang - Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển nấm - Viện di truyền Nông nghiệp.
3.2.2. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 2 năm 2016 đến tháng 2 năm 2018.
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu ảnh hƣởng của hàm lƣợng saccarozo, lƣu lƣợng sục khí, thời gian nuôi đến sinh trƣởng, phát triển hệ sợi nấm Địa sâm (Coprinus comatus) trong giai đoạn nhân giống cấp 2 dịch thể.
Nghiên cứu ảnh hƣởng của lƣợng giống cấy cấp 2, loại giá thể, ẩm độ giá thể, nhiệt và ẩm độ không khí, loại đất phủ đến sinh trƣởng, phát triển nấm Địa sâm (Coprinus comatus) trong giai đoạn nuôi trồng nấm thƣơng phẩm.
3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trong nghiên cứu này, nấm Địa sâm (Copritus comanus) đƣợc nuôi cấy thuần khiết trên ống nghiệm, công thức môi trƣờng đƣợc sử dụng để nhân giống là môi trƣờng YEPD (glucozo 20g/l; CNM 10g/l; pepton 20g/l; agar 15g/l) (Phạm Thị Thu và cs, 2016). Nhiệt độ và pH tối ƣu cho sự sinh trƣởng hệ sợi của nấm Địa sâm là 25 ±10C, pH 7,0. Sau khi cấy giống ống nghiệm đƣợc chuyển vào nơi tối để ƣơm. Quá trình nuôi sợi kéo dài 10-12 ngày, trong suốt thời gian này cần tiến hành định kỳ chọn nhiễm và kiểm tra hệ sợi để đánh giá chọn lựa đƣợc hệ sợi sinh trƣởng, phát triển tốt đạt yêu cầu để đƣa vào sản xuất.
Để chuẩn bị cho các thí nghiệm nhân giống dịch thể tiếp theo, tiến hành cấy 1 ống giống cấp 1 vào 200ml môi trƣờng dịch thể sau đó dùng máy nghiền để làm nhỏ hệ sợi nấm thành một dung dịch giống. Tỉ lệ giống cấy phụ thuộc vào từng thí nghiệm.
Các chai dịch ở các công thức thí nghiệm khác nhau sau khi đƣợc cấy giống sẽ đem đi ƣơm ở các chế độ khác nhau. Sau khi kết thúc giai đoạn ƣơm, mỗi chai dịch sẽ lấy 1ml dịch giống đổ vào lamen đƣa lên kính hiển vi Optika để đo kích thƣớc các khuẩn lạc cầu và 10ml dịch giống đổ vào đĩa peptri thêm 20ml nƣớc cất để xác định số lƣợng khuẩn lạc cầu. Sinh khối sợi nấm đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Park et al. (2001) đƣợc trình bày ở phần phƣơng pháp tiến hành.
3.4.1. Thiết kế thí nghiệm
3.4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng saccarozo/cao nấm men, tỉ lệ giống cấy, lưu lượng sục khí, thời gian nuôi giống đến sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm Địa sâm trong giai đoạn nhân giống cấp 2 dịch thể
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng saccarozo đến sinh trưởng hệ sợi nấm Địa sâm trong giai đoạn nhân giống cấp 2 dịch thể 200ml
Nhằm xác định đƣợc hàm lƣợng saccarozo thích hợp nhất cho sự sinh trƣởng phát triển của nấm Địa sâm, tác giả tiến hành bố trí thí nghiệm nghiên cứu các công thức nhƣ sau: CT 1: 10g saccarozo + 5g CNM+ 0,5 g/l MgSO4.7H2O và 1,0g/l KH2PO4 CT 2: 15g saccarozo + 5g CNM+ 0,5 g/l MgSO4.7H2O và 1,0g/l KH2PO4 CT 3: 20g saccarozo + 5g CNM + 0,5 g/l MgSO4.7H2O và 1,0g/l KH2PO4 CT 4: 25g saccarozo + 5g CNM + 0,5 g/l MgSO4.7H2O và 1,0g/l KH2PO4 CT 5: 30g saccarozo + 5g CNM + 0,5 g/l MgSO4.7H2O và 1,0g/l KH2PO4 Theo dõi xác định sinh khối sợi và mật độ khuẩn lạc cầu.
Các yếu tố phi thí nghiệm:
+ Tỷ lệ giống cấy: 10ml dịch giống cấy cấp 1 + Chế độ lắc: 150 vòng/phút, pH=7,0
+ Chế độ nuôi sợi:
Thời gian nuôi giống 4 ngày.
Nhiệt độ: 25±1oC.
Chế độ ánh sáng: Không cần ánh sáng.
Độ ẩm không khí: 65 - 70%. Thời gian tiến hành thí nghiệm: tháng 4/2017
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sinh trưởng của sợi nấm Địa sâm trong giai đoạn nhân giống cấp 2 trung gian dạng dịch thể 2000ml
Trong thí nghiệm này, tác giả sử dụng nguồn giống cấp 2 dịch thể 200ml để cấy vào bình Duran (5000ml) mỗi bình chứa 2000ml dịch. Lƣợng giống cấy vào bình gồm 5 công thức khác nhau, tỉ lệ thể tích so với môi trƣờng nhân nuôi.
CT1: 3% (60ml) CT2: 5% (100ml)
CT3: 7% (140ml)
CT4: 10% (200ml) CT5: 15% (300ml)
Các yếu tố phi thí nghiệm:
+ Giống cấp 2 dịch thể: đƣợc xác định ở thí nghiệm 1 + Tốc độ sục khí: 0,7V/V/M
+ Thời gian nuôi: 4 ngày + Chế độ nuôi sợi:
Nhiệt độ: 25±1oC.
Chế độ ánh sáng: Không cần ánh sáng.
Độ ẩm không khí: 65 - 70% Thời gian tiến hành thí nghiệm: tháng 4/2017
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của lưu lượng sục khí đến sinh trưởng
hệ sợi nấm Địa sâm trong giai đoạn nhân giống cấp 2 trung gian dạng dịch thể
2000ml
Tiến hành thí nghiệm với 5 mức sục khí khác nhau:
CT1: 0,4V/V/M CT3: 0,6V/V/M CT5: 0,8V/V/M
CT2: 0,5V/V/M CT4: 0,7V/V/M
Ghi chú: V/V/M (lít không khí/lít môi trƣờng/phút)
Các yếu tố phi thí nghiệm:
+ Môi trƣờng nhân giống: đƣợc xác định ở thí nghiệm 1 + Tỷ lệ giống cấy: tỉ lệ cấy giống xác định ở thí nghiệm 2 + Chế độ nuôi sợi:
Thời gian nuôi giống 4 ngày.
Nhiệt độ: 25±1oC.
Chế độ ánh sáng: Không cần ánh sáng.
Độ ẩm không khí: 65 - 70%. Thời gian tiến hành thí nghiệm: tháng 5/2017
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi giống đến sinh trưởng hệ sợi nấm Địa sâm trong giai đoạn nhân giống cấp 2 dịch thể
Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành nuôi giống nấm Địa sâm với các khoảng thời gian khác nhau:
CT1: sau nuôi 2 ngày CT3: sau nuôi 4 ngày CT5: sau nuôi 6 ngày CT2: sau nuôi 3 ngày CT4: sau nuôi 5 ngày
Theo dõi chu kỳ sinh trƣởng hệ sợi nấm trong môi trƣờng dịch để xác định thời điểm cấy giống tốt nhất.
Các yếu tố phi thí nghiệm:
+ Môi trƣờng nhân giống: đƣợc xác định ở thí nghiệm 1 + Tỷ lệ giống cấy: xác định ở thí nghiệm 2
+ Tốc độ sục khí: xác định ở thí nghiệm 3 + Chế độ nuôi sợi:
Nhiệt độ: 25±1oC.
Chế độ ánh sáng: Không cần ánh sáng.
Độ ẩm không khí: 65 - 70%. Thời gian tiến hành thí nghiệm: tháng 5/2017
3.4.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của loại giá thể, độ ẩm cơ chất, nhiệt độ không khí, độ ẩm không khí, loại đất phủ đến sinh trưởng phát triển nấm Địa sâm trong giai đoạn nuôi trồng
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại cơ chất phối trộn đến sinh trưởng phát triển nấm Địa sâm trong giai đoạn nuôi trồng
Giống nấm Địa sâm đƣợc nuôi trồng trong các môi trƣờng cơ chất phối trộn theo bảng sau:
Bảng 3.2. Thành phần giá thể nuôi trồng nấm Địa Sâm
Đơn vị tính: % theo khối lƣợng
Nguyên liệu (%) Công thức Lõi ngô Rơm Mùn cƣa Bông Cám ngô Cám gạo CaCO3 1 45 - - 44 5 5 1 2 - - 44 45 5 5 1 3 - 89 - - 5 5 1 4 45 - 44 - 5 5 1
Các yếu tố phi thí nghiệm:
+ Giống cấp 2 dịch thể: đƣợc xác định ở thí nghiệm 1,2,3,4 + Lƣợng giống cấy: 30ml/bịch
+ Khối lƣợng bịch nguyên liệu: 1,6kg + Chế độ nuôi sợi: Nhiệt độ: 25±1oC. Chế độ ánh sáng: Không cần ánh sáng. Độ ẩm không khí: 65 - 70%. + Chế độ ra quả thể: Nhiệt độ: 18±20C Chế độ ánh sáng: 500lux Độ ẩm không khí: 85±2%
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất đến sinh trưởng phát triển nấm Địa sâm trong giai đoạn nuôi trồng
Trong giai đoạn nuôi trồng chúng tôi đã tiến hành đánh giá 3 mức độ ẩm nguyên liệu khác nhau:
CT2: 65% ± 2 CT3: 75% ± 2 Các yếu tố phi thí nghiệm:
+ Giống cấp 2 dịch thể: đƣợc xác định ở thí nghiệm 1,2,3,4 + Lƣợng giống cấy: 30ml/bịch
+ Cơ chất nuôi trồng: đƣợc xác định ở thí nghiệm 5 +Khối lƣợng bịch nguyên liệu: 1,6kg
+ Chế độ nuôi sợi: Nhiệt độ: 25±1oC. Chế độ ánh sáng: Không cần ánh sáng. Độ ẩm không khí: 65 - 70%. + Chế độ ra quả thể: Nhiệt độ: 18±20C Chế độ ánh sáng: 500lux Độ ẩm không khí: 85±2%
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sinh trưởng phát triển nấm Địa sâm trong giai đoạn nuôi trồng
Sau khi sợi nấm ăn kín bịch nguyên liệu, chúng tôi tiến hành theo dõi sự hình thành mầm quả thể và năng suất nấm tƣơi ở 04 ngƣỡng nhiệt độ khác nhau:
CT1 = 14 ± 20C CT3 = 24 ± 20C CT2 = 18 ± 20C CT4 = 28 ± 20C Các yếu tố phi thí nghiệm:
+ Bịch nguyên liệu đƣợc đặt trong phòng có điều hoà nhiệt độ.