3.4.2.1. Phương pháp phân tích chất lượng nguyên liệu lá tía tô và sản phẩm
a) Xác định độ ẩm của nguyên liệu bằng phương pháp chưng cất với Toluen
Cân chính xác 10g nguyên liệu đã được cắt nhỏ và đong 150 ml dung dịch Toluen đổ ngập nguyên liệu, rồi cho vào bình cầu có dung tích 500 ml. Lắp dụng cụ xác định thủy phần cùng với sinh hàn hồi lưu. Đun sôi hỗn hợp trong bình đến nhiệt độ soi cho tới khi không nhìn thấy nước ra ở dụng cụ xác định thủy phần thì ngừng đun. Để hỗn hợp phân lớp trong thì đọc thể tích nước ở dụng cụ đo. Hàm lượng nước trong lá tía tô nguyên liệu được xác định theo công thức sau:
W = Trong đó:
+ W: Độ ẩm của nguyên liệu (%) + m: Khối lượng nguyên liệu (g)
+ V: Thể tích thu được ở dụng cu đo (ml) + d: Tỷ trọng của nước (g/ml)
V.d.100% m
b) Xác định hàm lượng tinh dầu trong nguyên liệu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn theo hơi nước
Cân chính xác 200g nguyên liệu đã được cắt nhỏ và đong 1200 ml ( sao cho nguyên liệu ngập trong nước), cho vào bình tam cầu 2000 ml rồi đem chưng cất tinh dầu theo phương pháp chưng cất lôi cuốn theo hơi nước bằng bộ xác định hàm lượng tinh dầu nhẹ Clevender. Quá trình kết thúc khi lượng tinh dầu trong ống thu nhận không tăng lên. Để đảm bảo tinh dầu trong nguyên liệu được khai thác triệt để, chúng tôi tiến hành chưng cất trong thời gian 4,5h. Tinh dầu thô thu nhận được còn lẫn nước được chiết bằng ethyl acetate, làm khan bằng Na2SO4
sau đó đem cô quay để đuổi dung môi, thu được tinh dầu nguyên chất. Hàm lượng tinh dầu có trong nguyên liệu được xác định theo công thức:
( ) 4 1 2 . 10 (%) . 100 m m W X − = Trong đó:
+ X: Hàm lượng tinh dầu tính theo chất khô trong nguyên liệu + m2: Khối lượng tinh dầu thu được (g)
+ m1: Khối lượng nguyên liệu (g) + W: độ ẩm của nguyên liệu (%)
c) Xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định theo mô tả của Yadav và Agawala (2011). Sử dụng methanol pha loãng mẫu cao chiết để đạt nồng độ 1mg/ml và dung dịch chuẩn axit gallic nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 và 120 µg/ml; thuốc thử Folin- Ciocalteu 10% được pha loãng với nước.
Lần lượt cho 1ml dung dịch axit gallic nồng độ (20, 40, 60, 80, 100, 120 µg/ml) vào 2,5 ml thuốc thử Folin- Ciocalteu 10% và để phản ứng trong 5 phút; sau đó thêm vào 2 ml dung dịch Na2CO3 2%. Sau 45 phút phản ứng ở nhiệt độ phòng, độ hấp phụ được xác định bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 765 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Giá trị OD được ghi nhận và tiến hành vẽ đường thẳng hiệu chuẩn để sử dụng xác định hàm lượng polyphenol tổng trong mẫu. Các mẫu cao chiết được tiến hành tương tự với mẫu chuẩn axit gallic. Hàm lượng polyphenol tổng số được tính theo công thức:
P (mg/g) = m1 x V/m2
Trong đó:
+ m1: số mg polyphenol xác định theo đồ thị chuẩn với axit gallic + V: thể tích dung dịch cao chiết (ml)
+ m2 : khối lượng cao chiết có trong thể tích V (g)
* Xác định hàm lượng polyphenol tổng số trong nguyên liệu lá tía tô
Để xác định được hàm lượng polyphenol tổng số trong nguyên liệu lá tía tô, trước hết, cần chiết tách được tối đa các hợp chất polyphenol có trong nguyên liệu. Cách làm như sau: Cân chính xác 10 g nguyên liệu đã được xay nhỏ cho vào bình cầu (V = 250 ml). Thêm vào đó 150 ml methanol 80%, trích ly hồi lưu trong thời gian 4 h, lọc dịch chiết, cô bớt dung môi, sau đó đưa về thể tích 50 mL dung dịch để phân tích.
Tiếp đó, xác định hàm lượng polyphenol tổng số (tính theo axit gallic) trong dịch chiết thu được với thuốc thử Folin- Ciocalteu 10% tương tự như xác định hàm lượng polyphenol tổng số trong cao chiết như đã trình bày ở trên.
Hàm lượng polyphenol tổng số trong nguyên liệu thường được tính theo % tổng chất khô có trong nguyên liệu với công thức như sau:
P % = (m1.V.100)/(m2.v.1000) Trong đó:
P: hàm lượng polyphenol tính theo % chất khô của nguyên liệu m1: số mg polyphenol xác định theo đồ thị chuẩn với axit gallic v: số ml dịch chiết lấy làm thí nghiệm
V: tổng số dịch chiết của mẫu nghiên cứu (ml)
m2: khối lượng chất khô của mẫu nguyên liệu có trong thể tích V (g) 100: tính ra %
1000: hệ số chuyển g thành mg
d) Xác định hàm lượng flavonoid tổng số
Hàm lượng flavonoid tổng số được xác định theo mô tả của Chang et al
(2002). Metanol được sử dụng pha loãng cao chiết để đạt nồng độ 1mg/ml và dung dịch chuẩn quercetin đạt nồng độ 20, 40, 60, 80 và 100 µg/ml; dung dịch AlCl3 10% và dung dịch CH3COOK 1M được pha loãng với nước.
Lần lượt cho 0,5 ml dung dịch quercetin (nồng độ 20, 40, 60, 80 và 100 µg/ml) vào 1,5 ml MeOH và để phản ứng trong 5 phút. Sau đó, thêm tiếp 0,1 ml AlCl3 và để phản ứng trong 6 phút. Cuối cùng, hỗn hợp được thêm vào 0,1 ml
CH3COOK 1M và 2,8 ml nước cất, lắc đều rồi để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 45 phút. Sau 45 phút, tiến hành xác định độ hấp phụ bằng máy đo quang phổ ở 415 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Giá trị OD được ghi nhận và tiến hành vẽ đường thẳng hiệu chuẩn để sử dụng xác định hàm lượng flavonoid tổng trong mẫu. Các mẫu cao chiết được tiến hành tương tự với mẫu chuẩn quercetin.
Hàm lượng flavonoid tổng số được tính theo công thức: F (mg/g) = m3 x V/m4
Trong đó:
+ F: Hàm lượng Flavonoid tổng ( mg quercertin/g chiết xuất) + m3 : số mg flavonoid xác định theo đồ thị chuẩn với quercetin
+ V: thể tích dung dịch cao chiết (ml)
+ m4 : khối lượng cao chiết có trong thể tích V (g)
* Xác định hàm lượng flavonoid tổng số trong nguyên liệu lá tía tô
Để xác định được hàm lượng flavonoid tổng số trong nguyên liệu lá tía tô, trước hết, cần chiết tách được tối đa các hợp chất flavonoid có trong nguyên liệu. Cách làm như sau: Cân chính xác 10 g nguyên liệu đã được xay nhỏ cho vào bình cầu (V = 250 ml). Thêm vào đó 150 ml methanol 80%, trích ly hồi lưu trong thời gian 4 h, lọc dịch chiết, cô bớt dung môi, sau đó đưa về thể tích 50 mL dung dịch để phân tích.
Tiếp đó, xác định hàm lượng flavonoid tổng số (tính theo quercetin) trong dịch chiết thu được tương tự như xác định hàm lượng flavonoid tổng trong cao chiết như đã trình bày ở trên. Hàm lượng flavonoid tổng số trong nguyên liệu thường được tính theo % tổng chất khô có trong nguyên liệu với công thức như sau:
F % = (m3.V.100)/(m4.v.1000) Trong đó:
F: hàm lượng flavonoid tính theo % chất khô của nguyên liệu m3: số mg flavonoid xác định theo đồ thị chuẩn với quercetin v: số ml dịch chiết lấy làm thí nghiệm
V: tổng số dịch chiết của mẫu nghiên cứu (ml)
m4: khối lượng chất khô của mẫu nguyên liệu có trong thể tích V (g) 100: tính ra %
Hiệu suất chiết tách được tính theo công thức: X = m1/m2.100 (%) Trong đó:
X: Hiệu suất chiết tách polyphenol tổng số (hoặc flavonoid tổng số) % m1: Lượng polyphenol tổng số (hoặc flavonoid tổng số) có trong nguyên liệu đem chiết tách, g
m2: Khối lượng polyphenol tổng số (hoặc flavonoid tổng số) trong cao chiết thu được, g
e) Xác định hàm lượng axít rosmarinic bằng phương pháp so màu quang phổ với máy UV- Spectrophotometter
a. Nguyên tắc: axit rosmarinic tạo phức chất màu vàng sáng với Zr4+ ,có độ hấp phụ màu trên máy spectrophotometer cao nhất ở bước sóng 362nm.
b. Hóa chất và thiết bị
- Axit rosmarinic (97%) – Sigma –Aldrich ( Chemie, GmbH Steinheim, Đức)
- Zirconium (IV) oxide chloride octahydrate (ZrOCl2.8H2O)- Merck (KgaA, Darmstadt, Đức)
- Dung môi, hóa chất khác thuộc loại hóa chất tinh khiết phân tích.
- Máy Spectrophotometer: UV –Visible spectrophotometric Shimadzu 1601(Kyoto, Japan).
* Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
- Dung dịch chuẩn của axit rosmarinic có nồng độ 10-3M (0,0901g hòa tan trong cồn và định mức tới 250ml)
- Dung dịch Zirconium (IV) oxide chloride: nồng độ 0,5M (hòa tan 1,6117g trong nước và định mức đến 10 ml bằng nước).
- Dung dịch chiết tách mẫu: dung dịch methanol 0,125M pha trong ethanol 96%, pha trước khi dùng.
Phương pháp chiết mẫu: 25 g mẫu khô ngâm trong 100 ml dung môi /lần, chiết 3 lần/24h. Cô chân không loại hết dung môi. Phần kết tủa hòa tan trong 100 ml ethanol 96%.
* Dựng đường chuẩn axit rosmarinic:
Pha các mẫu dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 50, 70, 125, 150, 175 và 200µl từ dung dịch tiêu chuẩn trong các ống mẫu khác nhau có dung tích 5ml, thêm 4,6ml ethanol, lượng dung dịch axit rosmarinic gốc với hàm lượng xác định và lượng ethanol = (200-x)µl. Thêm dung dịch Zr ( nồng độ 200µl) vào mỗi ống chuẩn, trộn đều . Sau 5 phút, đem xác định độ hấp phụ trên máy UV ở bước sóng 362nm, mẫu blank là nước cất tinh khiết. Dựng đường chuẩn bằng phương pháp tính graph trên excel 2007. Tính chỉ số R
c. Phương pháp tính: Nồng độ của axit rosmarinic trong dịch chiết được
tính bằng công thức sau, dựa trên đồ thị hàm lượng rosmarinic tiêu chuẩn: Độ hấp thụ = [0,0266µM acid – 0,0269.]*R.
f) Xác định hàm lượng anthocyanin
Anthocyanin tổng số được xác định theo phương pháp pH vi sai (Metivier et al., 1980).
Lọc mẫu qua màng lọc 0,45μm rồi tiến hành pha loãng 10 lần với cả 2 dung dịch đệm, trường hợp màu đậm quá có thể pha loãng trước bằng nước cất hoặc pha loãng nhiều lần hơn bằng dung dịch đệm. Sau đó đặt ở chỗ tối trong vòng 1 giờ cho màu sắc ổn định. Sau đó đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 524nm với mẫu trắng là các dung dịch đệm tương ứng.
Phương pháp tính
Hàm lượng anthocyanin tổng số được tính theo malvidinclorua-3,5- glucozit theo công thức:
TA (Total anthocyanins) = (A520pH 1,0 – A520pH 4,5) x 25,575 x f (mg/l). Trong đó
TA - Hàm lượng anthocyanin tổng số
A520 pH 1,0 - Độ hấp thụ ở 520 của mẫu pha loãng 10 lần bằng đệm pH 1,0
A520 pH 4,5 - Độ hấp thụ ở 520 của mẫu pha loãng 10 lần bằng đệm pH 4,5
255,75 - Hệ số quy đổi từ giá trị độ hấp thụ thành hàm lượng mg/l f - Hệ số pha loãng
g) Xác định các chỉ tiêu vi sinh vật
* Phân tích VSV tổng số theo TCVN 4884:2005
- Nguyên tắc: Tổng số vi sinh vật hiếu khí được xác định bằng cách chuẩn bị một dãy các nồng độ pha loãng mẫu theo các nguyên tắc chung vi sinh, sau đó cho vào đĩa petri môi trường đổ đĩa. ủ các mẫu trong điều kiện hiếu khí ở 300C trong 3 ngày, hoặc 200C trong 3 ngày, hoặc 6.50C trong 10 ngày. Số lượng vi sinh vật hiếu khí trên 1ml hoặc 1gam mẫu được tính từ các đĩa được chọn có số lượng khuẩn lạc đếm được.
- Chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị mẫu và xử lý mẫu (xem phương pháp 1 sổ tay 04.2-CL3/ST và hướng dẫn 3 sổ tay 04.1- CL3/ST). Đồng nhất mẫu (10g hoặc 10ml) và chuẩn bị các nồng độ pha loãng thích hợp.
- Cấy mẫu : Chuyển 1ml dịch mẫu sau khi đồng nhất và đã được pha loãng ở nồng độ thích hợp vào đĩa petri đã thanh trùng. Ngay sau đó, đổ mỗi đĩa 15-20ml môi trường nuôi cấy (PCA) đã đun tan và được làm nguội ở 45.0±1.00C
Trộn đều hỗn hợp thành phần có trong đĩa để chắc chắn rằng các đĩa đặt trên mặt phẳng nằm ngang cho đông tự nhiên.
- Nuôi ủ:
Các đĩa được lật ngược và ủ ở một trong 3 chế độ nhiệt độ sau: 30.0 ±1.0oC trong 72 + 6 giờ.
20.0 ±1.0oC trong 72 + 6 giờ 6.5 ±1.0oC trong 10 ngày. - Đọc kết quả:
Chọn những đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 và đếm bằng máy đếm khuẩn lạc hoặc kính lúp.
- Báo cáo kết quả:
+ Nếu chỉ có một đĩa có số lượng khuẩn lạc từ 25-250 thì số lượng vi sinh vật trong 1gam (hoặc 1ml) mẫu được tính bằng cách lấy số lượng khuẩn lạc đếm được nhân với nồng độ pha loãng.
+ Nếu các đĩa ở hai nồng độ liên tiếp có khuẩn lạc nằm trong khoảng 25- 250 thì việc tính giá trị trung bình theo báo cáo NMKL số 5.
Báo cáo kết quả số vi khuẩn hiếu khí trong 1gam (hoặc 1ml) mẫu phải được thể hiện bằng biểu thức: a x 10n
Trong đó:
a: số thập phân tương ứng (gồm hai chữ số có nghĩa) từ 1.0 đến 9.9. n: số mũ phù hợp 10.
- Tính tổng số vi sinh vật trong 1 g hoặc 1 ml mẫu theo công thức: N
Cs = ---
(n1 V1 F1) + (n2 V2 F2) + ... + (ni Vi Fi) Trong đó :
Cs: Tổng số vi sinh vật trong 1 g (hoặc 1 ml) mẫu (CFU/g hoặc ml) N: Tổng số khuẩn lạc đếm được ở tất cả các đĩa
n1, n2, ... ni: Số đĩa đếm được ở mỗi nồng độ tương ứng (ở phương pháp này n=1)
V1, V2, ... Vi: Số ml dịch mẫu được cấy F1, F2, ... Fi: Nồng độ pha loãng tương ứng.
* Phân tích Coliforms theo TCVN 6187-2:1996.
- Nguyên tắc: Số lượng Coliforms được xác định bằng cách cấy lượng mẫu đã xác định lên môi trường rắn chọn lọc thích hợp có chứa lactose. Thực hiện ủ sơ bộ trên môi trường dinh dưỡng không chọn lọc nếu vi khuẩn bị tổn thương trong quá trình chế biến. Sau khi ủ sơ bộ ở 20 -25oC (nhiệt độ phòng) trong 1-2 giờ, phủ lên một lớp môi trường rắn chọn lọc có chứa lactose. Nuôi cấy các đĩa ở 37oC trong 24 giờ hoặc ở 30 oC đối với sữa và sản phẩm sữa trước khi đếm các khuẩn lạc điển hình. Chọn những khuẩn lạc điển hình khẳng định bằng canh Brilliant green bile lactose, Coliforms sẽ sinh khí trong môi trường này ở
37oC trong 24 giờ.
- Chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị mẫu và pha loãng (xem phương pháp 1 sổ tay 04.2-CL3/ST và hướng dẫn 3 sổ tay 04.1-CL3/ST). Đồng nhất mẫu (10g hoặc 10ml) và chuẩn bị các nồng độ pha loãng thích hợp.
- Đổ đĩa:
Petri. Thêm 10-15ml môi trường thạch VRB được làm nguội ở 45.0oC. Trộn đều mẫu bằng cách xoay tròn đĩa theo chiều và ngược chiều kim đồng hồ. Sau khi môi trường đông, thêm 1 lớp mỏng môi trường thạch VRB lên đĩa.
+ Thực hiện quá trình ủ sơ bộ khi cần thiết như sau: đầu tiên đổ 5ml thạch TSA đã được làm nguội ở 45.0 ±1.0oC, để đĩa ở nhiệt độ phòng (20 -250C) trong 1-2 giờ. Sau khi môi trường đông, đổ tiếp lên 10-15ml môi trường thạch VRB đã được làm nguội ở 45.0±1.0oC. Tỉ lệ độ dày của hai lớp môi trường trên (VRB):dưới (TSA) ít nhất là 2:1.
- Nuôi ủ: Các đĩa được lật ngược và ủ ở 37.0± 1.0 oC trong 24±3 h. Đối với sữa và sản phẩm sữa ủ các đĩa ở 30.0± 1.0 oC trong 24±3 h.
- Đọc kết quả: Đếm các đĩa từ 10-100 khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc
nghi ngờ. Những đĩa có số lượng nhiều thì khuẩn lạc sẽ nhỏ và không rõ ràng. Đếm tất cả các khuẩn lạc được xem là Coliforms giả định có màu đỏ sậm, được bao quanh vùng kết tủa màu đỏ.
- Báo cáo kết quả: Kết quả đếm Coliforms trong 1 g bằng cách nhân số khuẩn lạc đã đếm với nồng độ pha loãng và tỷ lệ xác định.
Trong trường hợp ở nồng độ pha loãng thấp nhất (10-1 ) mà không có khuẩn lạc điển hình hay tỷ số khẳng định bằng 0, thì kết quả được báo cáo là <10 CFU/g.
* Phân tích E. coli theo TCVN 6187-2:1996
- Nguyên tắc: Số lượng Coliforms chịu nhiệt được xác định bằng cách cấy
lượng mẫu đã xác định lên môi trường rắn không chọn lọc. Sau khi ủ sơ bộ ở 20 -25oC (nhiệt độ phòng) trong 1-2 giờ, phủ lên một lớp môi trường rắn chọn lọc có chứa lactose. Nuôi cấy các đĩa ở 44oC trong 24 giờ, sau đó đếm những khuẩn lạc