3.1.1. Nguyên liệu
Lá tía tô Perilla frutescens var. crispa được thu hái ở vùng Đông Anh,
Đông Dư, Thường Tín (Hà Nội), Võ Cường (Bắc Ninh), Vạn Hòa (Lào Cai), Ngọc Hà (Hà Giang), Tân Yên (Bắc Giang), Văn Lâm (Hưng Yên) vào tháng 3 năm 2018. Lá tía tô được thu hái khi cây chuẩn bị ra hoa (bắt đầu xuất hiện nhưng chồi hoa đầu tiên), có chất lượng đồng đều, tươi, không bị sâu bệnh. Lá tía tô nguyên liệu phải được thu hái trong điều kiện khô ráo để đảm bảo sự đồng đều trong các mẫu khảo sát. Lá tía tô mua về được trải mỏng để nơi thoáng mát bảo quản ở nhiệt độ phòng và tiến hành lấy mẫu nghiên cứu trong vòng 24 giờ (h).
Hình 3.1. Nguyên liệu lá tía tô 3.1.2. Hóa chất + Cồn thực phẩm (C2H5OH) 96% + Metanol, Propan + Nước cất + Etyl acetate (C3H8O2) + Toluen ( C6H5CH3)
+ Acid citrit
+ Aluminium Chloride (AlCl3) + Sodium Carbonat (Na2CO3) + Kali acetat (CH3COOK) + Acid Gallic, Quercertin + Thuốc thử Folin – Ciocalteu
+ Dung dịch DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
3.1.3. Thiết bị
+ Bộ chưng cất tinh dầu nhẹ Clenvenger + Máy cô quay Buchi B-480
+ Tủ sấy, bếp đun
+ Máy đo quang phổ UV Vis
+ Cân kỹ thuật, cân phân tích, bình hút ẩm + Bình cầu các loại gắn với sinh hàn hồi lưu
+ Phễu triết, phễu lọc, cốc đong, ống đong, bình tam giác, bình định mức. + Ống nghiệm các loại.
+ Pipet, buret, giấy lọc, nhiệt kế.
Hình 3.2. Thiết bị cân điện tử Hình 3.3. Tủ sấy
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
− Phân tích đánh giá chất lượng nguyên liệu lá tía tô
− Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện công nghệ đến quá trình chiết tách hoạt chất chống oxy hóa từ lá tía tô.
− Xây dựng quy trình chiết tách hoạt chất chống oxy hóa từ lá tía tô. − Nghiên cứu làm giàu các hoạt chất chống oxy hóa từ cao chiết lá tía tô. − Phân tích đánh giá chất lượng sản phẩm đề tài.
− Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của các hợp chất chống oxy hóa từ lá tía tô.
3.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9 năm 2017 đến tháng 10/2018
- Địa điểm: Trung tâm Dầu, Hương liệu và Phụ gia thực phẩm - Viện Công nghiệp thực phẩm – Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Bố trí thí nghiệm 3.4.1. Bố trí thí nghiệm
Để lựa chọn được nguyên liệu thích hợp nhất cho mục đích chiết tách các hoạt chất chống oxy hóa từ cây tía tô, chúng tôi tiến hành phân tích các thành phần chính của lá tía tô lấy từ các vùng nguyên liệu: Lào Cai, Hà Giang, Bắc Giang, Bắc Ninh, Hưng Yên, và khu vực Hà Nội.
Nguyên liệu lá tía tô sau khi thu hoạch trước khi trích ly cần được xử lý để bảo quản và làm tăng hiệu quả quá trình trích ly thu nhận các chất chống oxy hóa.
3.4.1.1. Nghiên cứu chế độ xử lý nguyên liệu thích hợp cho quá trình chiết tách các hoạt chất chống ôxy hóa từ lá tía tô
Tiến hành khảo sát về ảnh hưởng của nhiệt độ sấy, độ ẩm nguyên liệu sau sấy và độ mịn nguyên liệu đến hiệu suất thu nhận thu nhận các chất chống oxy hóa.
Lá tía tô được dải mỏng, đều trong khay sấy, đặt trong thiết bị sấy đối lưu (có quạt gió), được sấy tại các mức nhiệt độ 50, 60, 70, 80 và 900C. Quá trình sấy kết thúc khi độ ẩm của nguyên liệu đạt mức 15%.
Khảo sát độ ẩm nguyên liệu sau khi sấy ở các mức: 8, 12, 15 và 18%. Nguyên liệu được xay nhỏ, rây qua mặt sàng các kích thước khác nhau. Độ mịn nguyên liệu được khảo sát là: d > 2mm, 1 ≤ d < 2mm, d < 1 mm.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên bộ thiết bị chiết tách các hoạt chất chống oxy hóa tại Trung tâm Dầu, Hương liệu và Phụ gia thực phẩm, Viện Công nghiệp Thực phẩm. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của một yếu tố nhất định thì các thí nghiệm đều được tiến hành ở cùng các điều kiện công nghệ (trừ điều kiện công nghệ đang được khảo sát). Mỗi mẻ thí nghiệm được thực hiện với các thông số công nghệ ban đầu như sau:
-Dung môi trích ly: ethanol 70% -Tỷ lệ bổ sung axit citric: 1,0%
-Tỷ lệ khối lượng nguyên liệu/thể tích dung môi: 1/12 (g/ml) -Số lần trích ly: 1 lần
-Nhiệt độ trích ly: 400C -Thời gian trích ly: 40 phút
-Tốc độ khuấy trộn: 100 vòng/phút
Mỗi thí nghiệm được tiến hành 3 lần lặp lại trong cùng một điều kiện công nghệ, sau đó lấy giá trị trung bình.
Dựa vào hiệu suất chiết tách các chất chống oxy hóa và hiệu quả kinh tế để lựa chọn các chế độ xử lý nguyên liệu thích hợp nhất.
Hiệu suất chiết tách được tính theo công thức: X = m2/m1.100 (%)
Trong đó: X: Hiệu suất chiết tách polyphenol tổng (hoặc flavonoid tổng) % m1: Lượng polyphenol tổng (hoặc flavonoid tổng) có trong nguyên liệu đem chiết tách, g
m2: Khối lượng polyphenol tổng (hoặc flavonoid tổng) trong cao chiết thu được, g
Sau khi đã chọn được giá trị thích hợp của các điều kiện đã được nghiên cứu thì giá trị đã lựa chọn được cố định trong các thí nghiệm tiếp theo để khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện còn lại.
3.4.1.2. Nghiên cứu các điều kiện công nghệ thích hợp cho quá trình chiết tách các hoạt chất chống ôxy hóa từ lá tía tô
Các điều kiện công nghệ trích ly chính được lựa chọn nghiên cứu gồm: loại dung môi trích ly, độ pH của dung môi, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, số lần trích, tốc độ khuấy trộn, nhiệt độ và thời gian trích ly.
- Tiến hành khảo sát loại dung môi trích ly: nước, propanol và ethanol (trong nước) ở các nồng độ: 40, 50, 60, 70 và 95%.
- Tỷ lệ axit citric bổ sung lần lượt là 1% (pH dung môi 6), 1.5% (pH dung môi 5.2), 2% (pH dung môi 4.4), 2.5% (pH dung môi 3.7).
- Để lựa chọn tỷ lệ khối lượng nguyên liệu trên thể tích dung môi và số lần trích ly chúng tôi bố trí thí nghiệm được thể hiện như sau:
Công thức Tỷ lệ khối lượng/ thể tích dung môi (số lần trích ly)
CT1 1/12 (1 lần)
CT2 1/15 (1 lần)
CT3 1/15 (lần 1: 1/10 và lần 2: 1/5) CT4 1/18 (lần 1: 1/12 và lần 2: 1/6)
CT5 1/18 (lần 1: 1/9, lần 2: 1/5 và lần 3: 1/4)
- Nhiệt độ trích lý được khảo sát ở các mức nhiệt độ: 40, 50, 60 và 700C. - Thời gian trích ly được khảo sát ở 40, 50, 60, 70 phút.
- Tốc độ khuấy trộn: 100, 200, 300, 400 vòng/phút.
Để nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện công nghệ đến quá trình chiết tách cách hợp chất chống oxy hóa từ lá tía tô, chúng tôi dựa trên nguyên tắc: Khi nghiên cứu ảnh hưởng của một yếu tố nhất định thì các thí nghiệm đều được tiến hành ở cùng các điều kiện công nghệ (trừ điều kiện công nghệ đang được khảo sát). Để lựa chọn các thông số công nghệ tối ưu cho quá trình chiết tách cách hợp chất chống oxy hóa từ lá tía tô, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên bộ thiết bị chiết tách các hoạt chất chống oxy hóa tại Trung tâm Dầu, Hương liệu và PGTP, Viện Công nghiệp Thực phẩm. Mỗi mẻ thí nghiệm được thực hiện với các thông số công nghệ ban đầu như sau:
-Tỷ lệ bổ sung axit citric: 1,0%
-Tỷ lệ khối lượng nguyên liệu/thể tích dung môi: 1/12 (g/ml) -Số lần trích ly: 1 lần
-Nhiệt độ trích ly: 400C -Thời gian trích ly: 40 phút
-Tốc độ khuấy trộn: 100 vòng/phút -Độ ẩm nguyên liệu sau sấy: 12%. -Độ mịn nguyên liệu: d<1mm.
Mỗi thí nghiệm được tiến hành 3 lần lặp lại trong cùng một điều kiện công nghệ, sau đó lấy giá trị trung bình.
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ khối các bước tiến hành nghiên cứu đề tài Nguyên liệu
Phân tích đánh giá chất lượng nguyên liệu
Xác định chế độ xử lý nguyên liệu Xác định chế độ trích ly thích hợp Phân tích đánh giá chất lượng sản phẩm Xác định các thành phần Độ ẩm nguyên liệu Độ mịn nguyên liệu
Loại dung môi trích ly
Độ pH của DM trích ly
Số lần trích ly Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi
Tốc độ khuấy trộn
Thời gian trích ly
Nhiệt độ trích ly
Làm giàu các hoạt chất chống oxy hóa
Lựa chọn DM tách tinh dầu
Lựa chọn DM tách tạp chất
Khảo sát khả năng chống oxy hóa của sản phẩm cao chiết lá tía tô
Việc lựa chọn loại dung môi thích hợp và các điều kiện công nghệ thích hợp cho việc chiết tách các chất chống oxy hóa từ lá tía tô dựa vào hiệu suất chiết tách được tính theo công thức:
X = m2/m1.100 (%) Trong đó:
X: Hiệu suất chiết tách polyphenol tổng (hoặc flavonoid tổng) % m1: Lượng polyphenol tổng (hoặc flavonoid tổng) có trong nguyên liệu đem chiết tách, g
m2: Khối lượng polyphenol tổng (hoặc flavonoid tổng) trong cao chiết thu được, g
Sau khi đã chọn được giá trị thích hợp của các điều kiện đã được nghiên cứu thì giá trị đã lựa chọn được cố định trong các thí nghiệm tiếp theo để khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện còn lại.
3.4.2. Phương pháp phân tích
3.4.2.1. Phương pháp phân tích chất lượng nguyên liệu lá tía tô và sản phẩm
a) Xác định độ ẩm của nguyên liệu bằng phương pháp chưng cất với Toluen
Cân chính xác 10g nguyên liệu đã được cắt nhỏ và đong 150 ml dung dịch Toluen đổ ngập nguyên liệu, rồi cho vào bình cầu có dung tích 500 ml. Lắp dụng cụ xác định thủy phần cùng với sinh hàn hồi lưu. Đun sôi hỗn hợp trong bình đến nhiệt độ soi cho tới khi không nhìn thấy nước ra ở dụng cụ xác định thủy phần thì ngừng đun. Để hỗn hợp phân lớp trong thì đọc thể tích nước ở dụng cụ đo. Hàm lượng nước trong lá tía tô nguyên liệu được xác định theo công thức sau:
W = Trong đó:
+ W: Độ ẩm của nguyên liệu (%) + m: Khối lượng nguyên liệu (g)
+ V: Thể tích thu được ở dụng cu đo (ml) + d: Tỷ trọng của nước (g/ml)
V.d.100% m
b) Xác định hàm lượng tinh dầu trong nguyên liệu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn theo hơi nước
Cân chính xác 200g nguyên liệu đã được cắt nhỏ và đong 1200 ml ( sao cho nguyên liệu ngập trong nước), cho vào bình tam cầu 2000 ml rồi đem chưng cất tinh dầu theo phương pháp chưng cất lôi cuốn theo hơi nước bằng bộ xác định hàm lượng tinh dầu nhẹ Clevender. Quá trình kết thúc khi lượng tinh dầu trong ống thu nhận không tăng lên. Để đảm bảo tinh dầu trong nguyên liệu được khai thác triệt để, chúng tôi tiến hành chưng cất trong thời gian 4,5h. Tinh dầu thô thu nhận được còn lẫn nước được chiết bằng ethyl acetate, làm khan bằng Na2SO4
sau đó đem cô quay để đuổi dung môi, thu được tinh dầu nguyên chất. Hàm lượng tinh dầu có trong nguyên liệu được xác định theo công thức:
( ) 4 1 2 . 10 (%) . 100 m m W X − = Trong đó:
+ X: Hàm lượng tinh dầu tính theo chất khô trong nguyên liệu + m2: Khối lượng tinh dầu thu được (g)
+ m1: Khối lượng nguyên liệu (g) + W: độ ẩm của nguyên liệu (%)
c) Xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định theo mô tả của Yadav và Agawala (2011). Sử dụng methanol pha loãng mẫu cao chiết để đạt nồng độ 1mg/ml và dung dịch chuẩn axit gallic nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 và 120 µg/ml; thuốc thử Folin- Ciocalteu 10% được pha loãng với nước.
Lần lượt cho 1ml dung dịch axit gallic nồng độ (20, 40, 60, 80, 100, 120 µg/ml) vào 2,5 ml thuốc thử Folin- Ciocalteu 10% và để phản ứng trong 5 phút; sau đó thêm vào 2 ml dung dịch Na2CO3 2%. Sau 45 phút phản ứng ở nhiệt độ phòng, độ hấp phụ được xác định bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 765 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Giá trị OD được ghi nhận và tiến hành vẽ đường thẳng hiệu chuẩn để sử dụng xác định hàm lượng polyphenol tổng trong mẫu. Các mẫu cao chiết được tiến hành tương tự với mẫu chuẩn axit gallic. Hàm lượng polyphenol tổng số được tính theo công thức:
P (mg/g) = m1 x V/m2
Trong đó:
+ m1: số mg polyphenol xác định theo đồ thị chuẩn với axit gallic + V: thể tích dung dịch cao chiết (ml)
+ m2 : khối lượng cao chiết có trong thể tích V (g)
* Xác định hàm lượng polyphenol tổng số trong nguyên liệu lá tía tô
Để xác định được hàm lượng polyphenol tổng số trong nguyên liệu lá tía tô, trước hết, cần chiết tách được tối đa các hợp chất polyphenol có trong nguyên liệu. Cách làm như sau: Cân chính xác 10 g nguyên liệu đã được xay nhỏ cho vào bình cầu (V = 250 ml). Thêm vào đó 150 ml methanol 80%, trích ly hồi lưu trong thời gian 4 h, lọc dịch chiết, cô bớt dung môi, sau đó đưa về thể tích 50 mL dung dịch để phân tích.
Tiếp đó, xác định hàm lượng polyphenol tổng số (tính theo axit gallic) trong dịch chiết thu được với thuốc thử Folin- Ciocalteu 10% tương tự như xác định hàm lượng polyphenol tổng số trong cao chiết như đã trình bày ở trên.
Hàm lượng polyphenol tổng số trong nguyên liệu thường được tính theo % tổng chất khô có trong nguyên liệu với công thức như sau:
P % = (m1.V.100)/(m2.v.1000) Trong đó:
P: hàm lượng polyphenol tính theo % chất khô của nguyên liệu m1: số mg polyphenol xác định theo đồ thị chuẩn với axit gallic v: số ml dịch chiết lấy làm thí nghiệm
V: tổng số dịch chiết của mẫu nghiên cứu (ml)
m2: khối lượng chất khô của mẫu nguyên liệu có trong thể tích V (g) 100: tính ra %
1000: hệ số chuyển g thành mg
d) Xác định hàm lượng flavonoid tổng số
Hàm lượng flavonoid tổng số được xác định theo mô tả của Chang et al
(2002). Metanol được sử dụng pha loãng cao chiết để đạt nồng độ 1mg/ml và dung dịch chuẩn quercetin đạt nồng độ 20, 40, 60, 80 và 100 µg/ml; dung dịch AlCl3 10% và dung dịch CH3COOK 1M được pha loãng với nước.
Lần lượt cho 0,5 ml dung dịch quercetin (nồng độ 20, 40, 60, 80 và 100 µg/ml) vào 1,5 ml MeOH và để phản ứng trong 5 phút. Sau đó, thêm tiếp 0,1 ml AlCl3 và để phản ứng trong 6 phút. Cuối cùng, hỗn hợp được thêm vào 0,1 ml
CH3COOK 1M và 2,8 ml nước cất, lắc đều rồi để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 45 phút. Sau 45 phút, tiến hành xác định độ hấp phụ bằng máy đo quang phổ ở 415 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Giá trị OD được ghi nhận và tiến hành vẽ đường thẳng hiệu chuẩn để sử dụng xác định hàm lượng flavonoid tổng trong mẫu. Các mẫu cao chiết được tiến hành tương tự với mẫu chuẩn quercetin.
Hàm lượng flavonoid tổng số được tính theo công thức: F (mg/g) = m3 x V/m4
Trong đó:
+ F: Hàm lượng Flavonoid tổng ( mg quercertin/g chiết xuất) + m3 : số mg flavonoid xác định theo đồ thị chuẩn với quercetin
+ V: thể tích dung dịch cao chiết (ml)
+ m4 : khối lượng cao chiết có trong thể tích V (g)
* Xác định hàm lượng flavonoid tổng số trong nguyên liệu lá tía tô
Để xác định được hàm lượng flavonoid tổng số trong nguyên liệu lá tía tô, trước hết, cần chiết tách được tối đa các hợp chất flavonoid có trong nguyên liệu. Cách làm như sau: Cân chính xác 10 g nguyên liệu đã được xay nhỏ cho vào bình cầu (V = 250 ml). Thêm vào đó 150 ml methanol 80%, trích ly hồi lưu trong thời gian 4 h, lọc dịch chiết, cô bớt dung môi, sau đó đưa về thể tích 50 mL dung dịch để phân tích.
Tiếp đó, xác định hàm lượng flavonoid tổng số (tính theo quercetin) trong dịch chiết thu được tương tự như xác định hàm lượng flavonoid tổng trong cao chiết như đã trình bày ở trên. Hàm lượng flavonoid tổng số trong nguyên liệu thường được tính theo % tổng chất khô có trong nguyên liệu với công thức như sau:
F % = (m3.V.100)/(m4.v.1000) Trong đó:
F: hàm lượng flavonoid tính theo % chất khô của nguyên liệu m3: số mg flavonoid xác định theo đồ thị chuẩn với quercetin v: số ml dịch chiết lấy làm thí nghiệm
V: tổng số dịch chiết của mẫu nghiên cứu (ml)
m4: khối lượng chất khô của mẫu nguyên liệu có trong thể tích V (g)