Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.5. Phương pháp phát hiện Bacillus cereus
Hiện nay, việc nhận biết chính xác B. cereus mất khá nhiều thời gian. Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, các nhà khoa học đang tìm ra những phương pháp tốt nhất để có thể phát hiện nhanh, chính xác B. cereus. Một số phương pháp đã
và đang được sử dụng để phát hiện B. cereus như:
2.5.1. Phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái và sinh lý sinh hóa
Hiện nay, phương pháp truyền thống để xét nghiệm B. cereus trong thực
phẩm dựa trên nguyên tắc nuôi cấy, phân lập vi khuẩn. Qui trình này phải trải qua nhiều bước: đồng nhất mẫu, tăng sinh, chọn lọc, xác định các tính chất hóa sinh.
Phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái:
• Trên mơi trường MPA: có thể sơ bộ phân biệt được B. cereus và B. mycoides do khuẩn lạc của B. mycoides có dạng dễ cây cịn khuẩn lạc B. cereus
lại có hình trịn, có tâm lồi, màu trắng sữa đến trắng đục.
• Trên mơi trường thạch MYP và mơi trường thạch Mossel (cereus selective agar) khuẩn lạc của B. cereus có đường kính 0,4 – 0,5µm, khuẩn lạc có màu hồng eosin hoặc xanh xung quanh có vùng kết tủa màu hồng hoặc xanh, có tâm lồi, bề mặt xù xì, khơng dính ướt, có vành ở mép [16].
Phương pháp dựa trên đặc điểm sinh lý sinh hóa
Đặc tính sinh lý sinh hố của B. cereus có rất nhiều điểm tương đồng với
các lồi cịn lại trong nhóm B. cereus đặc biệt là 3 loài B. thuringiensis, B. mycoides, B. anthracis như khả năng sinh catalase, gelatinase, khả năng lên men
glucose kỵ khí, phản ứng khử nitrat, phản ứng VP… Tuy nhiên, thơng qua một số đặc tính sinh lý, sinh hóa bước đầu có thể nhận biết được B. cereus với các
loài khác như khả năng chuyển động để phân biệt với B. anthracis và B. mycoides. Do hầu hết các chủng B. cereus và B. thuringiensis đều có khả năng
chuyển động nhờ lơng roi cịn B. anthracis và B. mycodes thì khơng. Ngồi ra,
trên mơi trường thạch huyết, có thể phân biệt được với B. anthracis do B.cereus
có khả năng phân giải huyết cịn B. anthracis thì khơng. Trong nhóm B. cereus
có nhiều đặc điểm sinh lý sinh hoá giống nhau. Hiện nay, người ta chỉ có thể phân biệt được chúng qua khả năng sinh tinh thể độc của B. thuringiensis sau 3 - 4 ngày nuôi cấy trong khi B. cereus và các lồi khác trong nhóm thì lại khơng có khả năng này. Tuy nhiên, phương pháp dựa trên đặc tính sinh lý, sinh hoá vẫn chưa đủ sức thuyết phục cho việc xác định chính xác vi khuẩn B. cereus [27].
- Ưu điểm của phương pháp này
Thao tác đơn giản.
Dễ làm.
Không phải đầu tư dụng cụ và thiết bị đắt tiền. - Nhược điểm
Độ nhạy không cao.
Thời gian để xác định tình trạng ô nhiễm thực phẩm do B. cereus lâu
(khoảng 5 – 7 ngày).
Tốn nhiều nhân cơng, cần có kỹ thuật viên có kinh nghiệm về vi sinh vật.
Khơng thể phát hiện được các chủng B. cereus này có hay khơng có sinh
độc tố do đó hạn chế trong cơng tác phịng ngừa.
Tốn nhiều hóa chất.
Yêu cầu kỹ năng thao tác.
2.5.2. Phương pháp miễn dịch
Phương pháp này dựa trên phản ứng của kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên bề mặt để phát hiện nhanh sự nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm.
Phản ứng kháng nguyên – kháng thể được xác định thông qua nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp quan sát sự kết tủa, sự ngưng kết, sự phát huỳnh quang, thơng qua hoạt tính enzym hay gắn đồng vị phóng xạ [3]. Hiện nay, kháng nguyên H của B. cereus đã được sử dụng để nhận dạng vi khuẩn
B. cereus bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang (Immumofluorescence)
hoặc phương pháp ELISA.
Phương pháp miễn dịch huỳnh quang:
Kháng nguyên H hoặc kháng thể của B. cereus được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang. Nếu có phản ứng kháng nguyên – kháng thể xảy ra thì dựa trên tính chất của thuốc nhuộm khi được kiểm tra bởi bức xạ hoặc bước sóng đặc hiệu chúng sẽ phát quang.
Phương pháp ELISA:
Phương pháp này được sử dụng nhiều nhất trong việc nhận dạng cũng như phân loại kiểu huyết thanh H của B. cereus. Phương pháp này dựa trên nguyên
tắc gắn kháng thể với enzym. Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzym sẽ thuỷ phân cơ chất giải phóng một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ xảy ra phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể.
Phương pháp này đơn giản và có độ nhạy gấp 10 – 500 lần so với phương pháp ngưng kết. Ngồi ra, phương pháp này cịn có thể xác định được nồng độ kháng nguyên thông qua cường độ màu. Hiện nay, không chỉ kháng nguyên H của B. cereus mà cả độc tố ruột enterotoxin của B. cereus cũng được phát hiện
thông qua các phương pháp này.
- Ưu điểm
• Độ nhạy cao, cho phép phát hiện các sản phẩm ở mức độ khoảng 10pg. • Thời gian cho kết quả nhanh hơn các phương pháp xét nghiệm truyền thống.
- Nhược điểm
Quy trình phức tạp, phải có những cán bộ kinh nghiệm và được đào tạo bài bản mới có thể thực hiện được.
2.5.3. Phương pháp dựa trên đặc điểm gen
Dựa trên đặc điểm gen mã hoá các loại độc tố
Hệ gen của vi sinh vật chứa tồn bộ thơng tin cần thiết cho sự sống sót và sinh trưởng của chúng. Mỗi gen mã hoá cho một protein liên quan trực tiếp hoặc gián tiếp cho chu trình sống của chúng. Hiện nay cùng với sự phát triển vượt bậc của các phương pháp sinh học phân tử đặc biệt là phương pháp PCR thì việc xác định các gen mã hóa các loại độc tố gây bệnh của vi khuẩn cũng như chính loại vi khuẩn đó trở nên dễ dàng hơn. Như đã biết B. cereus gây ngộ độc thực phẩm với 2 thể bệnh điển hình là nơn và tiêu chảy. Thể bệnh tiêu chảy do các độc tố ruột gây ra đặc biệt là do 2 độc tố HBL và NHE. Việc phát hiện gen mã hoá cho 3 protein thành phần của phức hợp HBL cũng như NHE đã được thực hiện bằng PCR [20].
Dựa trên trình tự rARN
Chuỗi 16S rARN có tác dụng khi xác định các loại vi khuẩn chưa biết. Nhưng trong nhóm B. cereus, việc phân biệt B. cereus với các lồi cịn lại gặp rất
nhiều khó khăn vì trình tự 16S rARN của nhóm này có mức tương đồng rất cao (99%) trong các nghiên cứu thông qua việc lai ADN – ADN và phép phân tích trình tự các gen trên rARN. Trình tự 16S rARN của B. mycodes, B. thuringiensis chỉ khác biệt với B. anthracis, B. cereus từ 0-9 nucleotit. Ngoài ra, Ash và
Collins đã thơng báo rằng trình tự 23S rARN của B. anthracis và các chủng B. cereus gây nôn là khá giống nhau [15]. Như vậy, các nghiên cứu đã cho thấy việc
sử dụng trình tự 16S rARN khơng thích hợp để phân biệt B. cereus với các lồi
khác trong nhóm B. cereus [33].
Dựa trên gen gyrB
Yamamoto và Harayama đã gợi ý sử dụng gen gyrB thay thế cho 16S rARN làm một marker phân loại phân tử cho các lồi vi khuẩn trong nhóm Bacillus cereus. Gen gyrB mã hóa tiểu phần protein B của ADN gyrase (topoisomerase
type II), gen này điều khiển sự siêu xoắn của 2 sợi DNA. Gen này có vai trị quan trọng trong q trình nhân bản của DNA. Do vậy, người ta đã tách dòng và giải trình tự gen gyrB có kích thước 1,2 Kb của 4 lồi trong nhóm Bacillus cereus (B.
cereus, B. antharcis, B. thuringiensis, B. mycoides).
Trên cơ sở đó, người ta đã thiết kế ra các cặp mồi dựa trên các đoạn đặc hiệu trong gen gyrB ở các loài trên và cặp mồi BC1 và BC2r đã được sử dụng để khuếch đại đoạn có kích thước 365bp của gen gyrB của B. cereus. Cặp mồi này có thể được sử dụng để nhận dạng B. cereus, nó mang tính đặc hiệu lồi chứ
không liên quan đến các nhân tố độc của chúng. Tuy nhiên đó cũng chưa phải là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định nhanh, chính xác bởi nó chỉ có vai trị trong việc phân biệt B. cereus và các lồi cịn lại trong nhóm mà đặc biệt là B. thuringiensis [41].
Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam các nhà khoa học đã và đang sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại để tìm ra phương pháp xác định
Bacillus cereus trong thực phẩm nhanh và chính xác.