Thành phần phản ứng PCR:
ADN mẫu 2,0 µl Nước khử ion 6,0 µl Master mix 10 µl Mồi 1,0 µl
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR
Mồi Nhiệt độ (oC) BceT 94 94 55 72 72 Giữ mẫu ở 4oC HblA 94 94 55 72 72 NheA 94 94 50 72 72 HblD 94 94 55 72 72 CytK 94 94 52 72 72 EntFM 94 94 55 72 72 Thời gian 5 phút 15 Giây 45 Giây 2 Phút 10 phút Chu kỳ 1 30 1
Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%.
3.2.5. Xác định độ nhạy trong phát hiện các gen mã hóa độc tố của chủng vi khuẩn bằng phương pháp PCR khuẩn bằng phương pháp PCR
Bước 1: Chuẩn bị các dung dịch nồng độ tế bào B. cereus cho định lượng vi
khuẩn và phản ứng PCR.
- Cấy chủng B. cereus lên đĩa thạch MPA. Ủ ở 370C/24 giờ
- Lấy lượng vi khuẩn ở một khuẩn lạc trên đĩa thạch MPA pha vào 1ml nước khử ion, ta có độ pha lỗng vi khuẩn là100 (huyền dịch ban đầu).
- Pha loãng bậc 10 huyền dịch vi khuẩn để tạo ra các nồng độ pha loãng vi khuẩn là: 10-1; 10-2; 10-3; 10-4; 10-5; 10-6, 10-7…
Lấy 100 µl huyền dịch vi khuẩn cho vào tube eppendorf 1,5 ml có chứa 900 µl nước khử ion, trộn đều bằng máy trộn voltex ta được độ pha loãng vi khuẩn là 10-1.
Lấy 100 µl ở độ pha lỗng vi khuẩn là 10-1 sang chứa 900 µl nước khử ion, trộn đều bằng máy trộn voltex ta được độ pha lỗng vi khuẩn là 10-2.
Lấy 100 µl ở độ pha loãng vi khuẩn là 10-2 sang chứa 900 µl nước khử ion, trộn đều bằng máy trộn voltex ta được độ pha loãng vi khuẩn là 10-3.
Tiếp tục pha lỗng như vậy ta sẽ có được nồng độ pha lỗng vi khuẩn từ huyền dịch ban đầu là 10-4; 10-5, 10-6, 10-7; 10-8.
Bước 2: Định lượng nồng độ vi khuẩn B. cereus/ml huyền dịch
- Láng đều 10 µl của 3 nồng độ pha loãng 10-6; 10-7 và 10-8 vào 3 đĩa thạch MPA. Ủ ở 370C/24 giờ.
- Đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa thạch MPA và tính số lượng vi khuẩn/ml huyền dịch. Cơng thức tính nồng độ vi khuẩn/ml huyền dịch:
𝑁 = ƩC
Ʃ𝑛 𝑣 𝑑
N: Số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu (CFU).
C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn (có số khuẩn lạc nằm trong khoảng từ 25-250 khuẩn lạc/đĩa).
ni: Số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ i di: Hệ số pha lỗng tương ứng
v: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
Bước 3: Khuếch đại trình tự gen mã hóa độc tố bằng phản ứng PCR với cặp
mồi đặc hiệu.
Lượng vi khuẩn ban đầu sau khi pha thành 6 nồng độ vi khuẩn khác nhau (từ 10-1 đến 10-6) được sử dụng để tiến hành các phản ứng PCR với 5 cặp mồi nhằm khuếch đại 5 gen mã hóa độc tố với chu trình cụ thể như bảng 3.3.
Thành phần phản ứng PCR:
Tế bào mẫu 2,0 µl Nước khử ion 6,0 µl Master mix 10 µl Mồi 1,0 µl
3.2.6. Phát hiện B. cereus chứa gen mã hóa độc tố trên thực phẩm giả định Bước 1: Chuẩn bị thực phẩm sạch Bước 1: Chuẩn bị thực phẩm sạch
Mẫu cơm vừa nấu chín được kiểm tra khơng bị nhiễm B. cereus bằng kỹ
thuật PCR trước khi gây nhiễm thực nghiệm:
1/ Cân 25g cơm cho vào bình chứa 225ml mơi trường làm giàu mẫu. Sau 15 – 24h làm giàu mẫu ở 37ºC, lấy 1ml dịch làm giàu tách chiết ADN (tương tự phần 2.2.3).
2/ Khuếch đại trình tự các gen mã hóa độc tố của B. cereus (tương tự bước 2 phần 3.2.4).
Nếu trên kết quả điện di khơng xuất hiện vạch băng thì mẫu cơm sử dụng là mẫu sạch.
Bước 2: Chuẩn bị B. cereus
Nuôi cấy và xác định nồng độ vi khuẩn B. cereus gây nhiễm được tiến hành như bước 1 của phần 3.2.5.
Bước 3: Gây nhiễm thực phẩm
Lấy 10g thực phẩm sạch ở trên trộn với 9800 µl nước khử ion và 100µl huyền dịch vi khuẩn B. subtilis có nồng độ vi khuẩn là 108 vi khuẩn/ml huyền dịch.
Lấy 100µl huyền dịch vi khuẩn B. cereus ở các nồng độ pha loãng 100; 10-1; 10-2; 10-3 lần lượt trộn vào hỗn hợp trên thu được các nồng độ vi khuẩn pha loãng 10-2; 10-3; 10-4; 10-5; 10-6.
Bước 4: Khuếch đại trình tự gen hblD bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc
hiệu.
Lượng vi khuẩn B. cereus đã được gây nhiễm ở 5 nồng độ pha loãng 10- 2;10-3; 10-4; 10-5; 10-6 được sử dụng để tiến hành các phản ứng PCR với cặp mồi HblD.
Thành phần phản ứng PCR:
Tế bào mẫu 2,0 µl Nước khử ion 6,0 µl Master mix 10 µl Mồi 1,0 µl
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. PHÂN LẬP Bacillus cereus
Các mẫu đất, thực phẩm sau khi được thu thập sẽ tiến hành phân lập như nội dung phương pháp. Đĩa nuôi cấy được ủ ở 37oC trong vòng 24h sẽ xuất hiện một số loại khuẩn lạc khác nhau. Dựa vào một số đặc điểm hình thái đặc trưng của vi khuẩn nhóm B. cereus bao gồm khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc và môi trường MPA, tế bào hình que xếp thành từng chuỗi, bắt màu nhuộm gram dương, sinh bào tử, chúng tôi đã chọn được 11 chủng phân lập tiêu biểu là C1.1, C1.3, CV1.6, B1.5 và D1.7, B1, B2, B3, B4, C, Đ. (Hình 4.1).
Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc chủng D1.7 khi phân lập trên môi trường
MYP (A) và trên môi trường MPA (B) sau 24h nuôi cấy ở 37oC.
Kết quả nhuộm Gram cho thấy 11 chủng trên có dạng hình que, bắt màu tím cho thấy các chủng này là trực khuẩn gram dương, là đặc điểm của các vi khuẩn thuộc nhóm B. cereus (hình 4.2A). Trong nhóm vi khuẩn B. cereus có 04 lồi bao gồm B. cereus, B. mycoides, B. thuringiensis, B. anthracis chúng mang rất nhiều các đặc điểm giống nhau vì vậy để xác định vi khuẩn B. cereus chúng tôi sẽ loại bỏ những chủng khác căn cứ vào những đặc điểm đặc trưng. Trên môi trường chọn lọc, 11 chủng này có khuẩn lạc màu phớt hồng, xung quanh khuẩn lạc có vùng kết tủa màu hồng (hình 4.1A). Trên mơi trường cơ bản MPA, khuẩn lạc có hình trịn, đường kính khoảng 0,2-0,3cm, màu trắng sữa hoặc trắng đục, có tâm lồi, mép khơng có dạng răng cưa (hình 4.1B). Dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc có thể thấy cả 11 chủng phân lập khơng phải là vi khuẩn B. mycoides trong
A B
nhóm B. cereus do khuẩn lạc của B. mycoides có dạng rễ cây trong khi đó các
lồi cịn lại trong nhóm B. cereus đều khơng có đặc điểm này. Kết quả nhuộm
màu bằng fushin bazơ thể hiện bào tử bắt màu hồng nhạt, có dạng elip, nằm ở trung tâm tế bào, vi khuẩn khơng sinh tinh thể sau 03 ngày ni cấy (hình 4.3). Điều này cho thấy các chủng phân lập không phải là vi khuẩn B. thurigiensis,
một thành viên khác trong nhóm B. cereus do B. thuringienis có khả năng sinh
tinh thể độc bắt màu tím đậm. Để kiểm tra hình thái tế bào của các chủng phân lập một cách chi tiết hơn, chúng tơi đã tiến hành quan sát hình thái tế bào của các chủng phân lập dưới kính hiển vi điện tử. Các chủng phân lập có dạng hình que, xếp thành chuỗi, hai cực của tế bào trịn (hình 4.2B). Điều này cho thấy chúng không phải là vi khuẩn B. anthracis vì vi khuẩn này có điểm đặc trưng là đầu tế bào hơi vuông. Đánh giá sơ bộ đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào các chủng vi khuẩn phân lập được có thể xếp chúng vào nhóm vi khuẩn B. cereus tuy nhiên cần phải có những nghiên cứu tiếp theo để khẳng định kết quả này.
Hình 4.2. Hình thái tế bào của chủng D1.7 sau 24h nuôi cấy ở 37oC quan sát trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần (A) và trên kính hiển vi
điện tử quét ở độ phóng đại 13000 lần (B)
A B
Hình 4.3. Hình thái bào tử chủng phân lập C1.1 sau 3 ngày nuôi cấy ở 37oC trên kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần.
4.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỢC CHỌN LỌC CHỌN LỌC
Hình thái là một trong những đặc điểm quan trọng để xác định vi khuẩn B.
cereus tuy nhiên chưa thể kết luận chính xác có phải là hay khơng, vì thế chúng
tơi tiếp tục nghiên cứu các đặc điểm sinh học quan trọng đặc trưng đối với các chủng phân lập đã tuyển chọn.
4.2.1. Khả năng sinh Catalase
Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme catalase là khi bổ sung H2O2 30% vào môi trường nuôi cấy, chúng đều có khả năng chuyển hóa H2O2 thành H2O và O2 thể hiện qua hiện tượng sủi bọt khí với các cường độ khác nhau.
Hình 4.4. Khả năng sinh Catalase của 11 chủng phân lập. Lần lượt từ 1 đến 5 là C1.1, B1.5, D1.7, C1.3 và CV1.6 (hình 4.4A).
A
Kết quả cho thấy các chủng phân lập được đều có khả năng sinh enzyme catalase với các cường độ khác nhau. Ta nhận thấy chủng B1.5 có khả năng sinh enzyme catalase mạnh nhất và chủng C1.1 có khả năng sinh enzyme catalase là yếu nhất (hình 4.4).
4.2.2. Khả năng sinh axetoin (Phản ứng V-P)
Phản ứng V-P dựa trên sự oxi hóa axetoin (axetylmethylcacbinol AMC) từ 2,3-butanediol thành diaxetyl được minh họa qua các phản ứng như sau :
Glucozơ + ½ O2 → 2,3 butanediol + H2O + 2CO2
2,3-butanediol axetoin
Axetoin + α – naphtol diacetyl
Diacetyl + guanidine nucleus phức diacetyl - guanidin Thuốc thử ) (có màu đỏ hồng nhạt)
Hình
Hình 4.5. Khả năng sinh axetoin của 11 chủng nghiên cứu. Lần lượt từ 1 đến 5 là CV1.6, D1.7, C1.3, C1.1 và B1.5 (hình A).
Hình 4.5 cho thấy cả 11 chủng phân lập đều có khả năng làm biến đổi màu môi trường thành màu hồng khi bổ sung thuốc thử, điều này cũng chứng tỏ 11 chủng phân lập có khả năng sinh axeton khá mạnh.
4.2.3. Khả năng sinh gelatinase
Các chủng tuyển chọn được ni cấy trên mơi trường có chứa gelatin (đơng đặc ở điều kiện lạnh), trong thời gian nuôi cấy chủng nào sinh ra gelatinase sẽ
2,3 butanediol dehydrogenase Oxi hóa
40% KOH O2 (Oxidized)
làm cho môi trường trở nên lỏng do gelatinase phân cắt gelatin thành các axit amin hịa tan vào mơi trường.
Hình 4.6. Khả năng sinh gelatinase của 11 chủng phân lập (Ống nghiệm để ngang) ngang)
Kết quả cho thấy cả 11 chủng đều có khả năng sinh gelatinase. Tuy nhiên có 2 chủng C1.3 và B1.5 thì khả năng sinh gelatinase cịn yếu (hình 4.6).
4.2.4. Khả năng phân giải thạch huyết
B. cereus có khả năng sinh haemolysin làm tan huyết là đặc điểm rất quan
trọng. Trong đó, haemolysin là một trong những độc tố quan trọng trong quá trình gây bệnh của B. cereus. Các chủng tuyển chọn được nuôi cấy trên môi
trường thạch máu cừu trong 24h, những chủng nào sinh haemolysin sẽ làm xuất hiện các vùng sáng xung quanh khuẩn lạc do chất này sinh ra làm cho các tế bào máu bị phân giải. Kết quả thử nghiệm cho thấy, trong 11 chủng phân lập thì chỉ có chủng D1.7, B1, B4, Đ có khả năng phân giải thạch huyết (hình 4.7).
Hình 4.7. Khả năng phân giải thạch huyết của các chủng phân lập
A B CV1.1 B1.5 D1.7 Đ B1 B4
Như vậy, 11 chủng B. cereus phân lập và tuyển chọn được trên môi trường chọn lọc và dựa trên hình thái khuẩn lạc, tế bào, bào tử đã được thu nhận và tiến hành nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy, các phản ứng sinh lý sinh hố để có thể so sánh chúng với các lồi cịn lại trong nhóm 1 chi Bacillus. Kết quả được tổng hợp ở bảng 4.1: