Phần 3 Vật liệu và phương pháp
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.5. Xác định độ nhạy trong phát hiện các gen mã hóa độc tố của chủng
pháp PCR
Bước 1: Tách chiết bộ gen vi khuẩn (quy trình tách DNA tổng số tương tự phần 3.2.3).
Bước 2: Khuếch đại trình tự gen mã hóa độc tố bằng phản ứng PCR.
DNA sau khi tách chiết xong được sử dụng để tiến hành các phản ứng PCR với 5 cặp mồi nhằm khuếch đại 5 gen mã hóa độc tố với chu trình cụ thể như bảng 3.3.
Thành phần phản ứng PCR:
ADN mẫu 2,0 µl Nước khử ion 6,0 µl Master mix 10 µl Mồi 1,0 µl
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR
Mồi Nhiệt độ (oC) BceT 94 94 55 72 72 Giữ mẫu ở 4oC HblA 94 94 55 72 72 NheA 94 94 50 72 72 HblD 94 94 55 72 72 CytK 94 94 52 72 72 EntFM 94 94 55 72 72 Thời gian 5 phút 15 Giây 45 Giây 2 Phút 10 phút Chu kỳ 1 30 1
Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%.
3.2.5. Xác định độ nhạy trong phát hiện các gen mã hóa độc tố của chủng vi khuẩn bằng phương pháp PCR khuẩn bằng phương pháp PCR
Bước 1: Chuẩn bị các dung dịch nồng độ tế bào B. cereus cho định lượng vi
khuẩn và phản ứng PCR.
- Cấy chủng B. cereus lên đĩa thạch MPA. Ủ ở 370C/24 giờ
- Lấy lượng vi khuẩn ở một khuẩn lạc trên đĩa thạch MPA pha vào 1ml nước khử ion, ta có độ pha lỗng vi khuẩn là100 (huyền dịch ban đầu).
- Pha loãng bậc 10 huyền dịch vi khuẩn để tạo ra các nồng độ pha loãng vi khuẩn là: 10-1; 10-2; 10-3; 10-4; 10-5; 10-6, 10-7…
Lấy 100 µl huyền dịch vi khuẩn cho vào tube eppendorf 1,5 ml có chứa 900 µl nước khử ion, trộn đều bằng máy trộn voltex ta được độ pha loãng vi khuẩn là 10-1.
Lấy 100 µl ở độ pha lỗng vi khuẩn là 10-1 sang chứa 900 µl nước khử ion, trộn đều bằng máy trộn voltex ta được độ pha loãng vi khuẩn là 10-2.
Lấy 100 µl ở độ pha lỗng vi khuẩn là 10-2 sang chứa 900 µl nước khử ion, trộn đều bằng máy trộn voltex ta được độ pha loãng vi khuẩn là 10-3.
Tiếp tục pha lỗng như vậy ta sẽ có được nồng độ pha loãng vi khuẩn từ huyền dịch ban đầu là 10-4; 10-5, 10-6, 10-7; 10-8.
Bước 2: Định lượng nồng độ vi khuẩn B. cereus/ml huyền dịch
- Láng đều 10 µl của 3 nồng độ pha lỗng 10-6; 10-7 và 10-8 vào 3 đĩa thạch MPA. Ủ ở 370C/24 giờ.
- Đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa thạch MPA và tính số lượng vi khuẩn/ml huyền dịch. Cơng thức tính nồng độ vi khuẩn/ml huyền dịch:
𝑁 = ƩC
Ʃ𝑛 𝑣 𝑑
N: Số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu (CFU).
C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn (có số khuẩn lạc nằm trong khoảng từ 25-250 khuẩn lạc/đĩa).
ni: Số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ i di: Hệ số pha lỗng tương ứng
v: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
Bước 3: Khuếch đại trình tự gen mã hóa độc tố bằng phản ứng PCR với cặp
mồi đặc hiệu.
Lượng vi khuẩn ban đầu sau khi pha thành 6 nồng độ vi khuẩn khác nhau (từ 10-1 đến 10-6) được sử dụng để tiến hành các phản ứng PCR với 5 cặp mồi nhằm khuếch đại 5 gen mã hóa độc tố với chu trình cụ thể như bảng 3.3.
Thành phần phản ứng PCR:
Tế bào mẫu 2,0 µl Nước khử ion 6,0 µl Master mix 10 µl Mồi 1,0 µl