Phần 3 Vật liệu và phương pháp
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.2. Phương pháp kiểm tra các chủng phân lập bằng đặc điểm hình thái và
một số phản ứng sinh hóa
Phương pháp nhuộm Gram
Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường MPA sau 1 ngày lấy ra làm tiêu bản theo phương pháp nhuộm Gram và soi kính ở vật kính dầu. Vi khuẩn Gram dương bắt màu lam – tím, cịn vi khuẩn Gram âm bắt màu đỏ tím của fushin.
Phương pháp nhuộm tinh thể
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường MPA sau 3 ngày lấy ra làm tiêu bản vết bôi. Sau đó tiêu bản được nhuộm với thuốc nhuộm tinh thể.
Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi với vật kính dầu, khi đó các bào tử có màu hồng sáng cịn các chủng có sinh tinh thể thì tinh thể bắt màu tím đậm.
Phương pháp xác định sự phân giải thạch huyết
Nuôi cấy tế bào vi khuẩn trên môi trường thạch huyết số 4 quan sát sự phân giải thạch huyết sau 1 ngày nuôi cấy. Vi khuẩn phân giải thạch huyết có tạo vịng phân giải có thể quan sát bằng mắt thường, ngược lại các vi khuẩn khơng tạo vịng phân giải thì khơng có khả năng phân giải thạch huyết.
Phản ứng sinh catalase
Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng lỏng MPB ở 30ºC, lắc 150v/p qua đêm. Sau đó bổ sung 0,5ml H2O2 30% vào ống nghiệm, nếu thấy có bọt khí sủi lên chứng tỏ phản ứng dương tính. Bọt khí sinh ra là do vi khuẩn khi phát triển sinh enzym catalase xúc tác phản ứng phân giải 2 H2O2 = O2 + 2H2O.
Phản ứng Voges- Proskauer (V-P)
Cấy vi khuẩn vào mỗi ống nghiệm chứa môi trường số 6 nuôi ở 30ºC, lắc 150v/p. Sau 48h nuôi cấy thêm vào mỗi ống nghiệm 0,6ml dung dịch VPA và 0,2ml dung dịch VPB rồi lắc mạnh. Vì tốc độ phản ứng phụ thuộc vào lượng oxy nên để ống nghiện mở nắp, nằm nghiêng để tăng diện tích tiếp xúc với khơng khí. Sau 10 – 30 phút nếu dung dịch chuyển sang màu hồng – đỏ thì phản ứng là dương tính. Phản ứng V – P để xác định sự hình thành axeton (axetyl metyl cacbinol) - một sản phẩm trung tính được hình thành trong quá trình lên men glucoza.
Phản ứng sinh gelatinase
Các chủng vi khuẩn được ni cấy trong mơi trường số 7 có chứa gelatin. Sau 2 ngày nuôi cấy đặt ống nghiệm vào đá, gelatin đông đặc trong điều kiện lạnh. Vì vậy, các chủng có khả năng sinh gelatinase sẽ dịch hố gelatin làm cho mơi trường không đông.