Độ nhạy của phản ứng là giới hạn phát hiện của phản ứng. Đó chính là nồng độ vi khuẩn (hoặc nồng độ DNA) tối thiểu mà phương pháp có thể phát hiện được. Nooratiny, I. and Sahilah, A. M (2013) đã sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện gen entFM và hblA mã hóa độc tố của B. cereus BC1. Giới hạn phát hiện của cả 2 gen này là 0.1 ng DNA [35].
Để xác định độ nhạy của phản ứng, tôi đã tiến hành định lượng vi khuẩn/ml ban đầu là 3,5x108 vi khuẩn/ml. Lượng vi khuẩn này được pha loãng bậc 10 tới nồng độ pha loãng 10-6 và được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR với 5 cặp mồi rồi chạy điện di trên gel agarose 1,5%. Kết quả điện di đối với cả 5 cặp mồi này (hình 4.11) cho thấy ở các nồng độ pha loãng vi khuẩn từ 10-1 đến 10-5, xuất hiện các vạch gọn, bờ đều, phân tách rõ ràng.
Điều này chứng tỏ có thể sử dụng phương pháp PCR để phát hiện gen độc tố của B. cereus và lượng vi khuẩn B. cereus D1.7 tối thiểu để có thể phát hiện
gen độc tố của B. cereus bằng phương pháp PCRlà 3,5x103 vi khuẩn/ml.
Hình 4.11. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi HblA (A), HblD (B), BceT (C), CytK (D), EntFM (E) trên gel agarose 1,5%. Giếng M: Marker O GeneRuler' TM 1kb DNA ladder (B, D); Marker O GeneRuler' TM 100bp DNA ladder (A, C, E); Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6 lần lượt tương ứng các nồng độ
pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 của B. cereus D1.7.
M 1 2 3 4 5 6 500bp 300bp 500bp 500bp M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6 500bp 400bp M 1 2 3 4 5 6 500bp 600bp M 1 2 3 4 5 6 500bp 1300bp A B C D E
4.6. PHÁT HIỆN Bacillus cereus CHỨA GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ TRÊN THỰC PHẨM GIẢ ĐỊNH
Nooratiny, I. and Sahilah, A. M (2013) đã sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện gen entFM và hblA mã hóa độc tố của B. cereus BC1 trên một số thực phẩm giả định tại nồng độ DNA thấp nhất là 0.1 ng/µl. Yang et al. (2005), Omboi et al.
(2008) cũng đã phát hiện trực tiếp một số gen mã hóa độc tố của B. cereus trên thực phẩm giả định bằng cách sử dụng multiplex PCR [35].
Trong nghiên cứu này, tôi tiến hành gây nhiễm thực nghiệm bằng cách trộn huyền phù vi khuẩn B. cereus và 1 loại vi khuẩn khác là B. subtilis đã biết trước nồng độ với thực phẩm sạch rồi sau đó tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi HblD.
Kết quả điện di ở hình 4.12 cho thấy ở các nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-
4, 10-5 của vi khuẩn B. cereus xuất hiện các vạch gọn, bờ đều, phân tách rõ ràng. Điều này chứng tỏ có thể sử dụng phương pháp PCR để phát hiện gen mã hóa chuỗi L2 của độc tố HBL của B. cereus trực tiếp từ thực phẩm giả định tại nồng độ vi khuẩn 3,5x103 vi khuẩn/ml.
Hình 4.12. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi HblD trên gel agarose 1,5%. Giếng M: Marker O GeneRuler' TM 100bp plus DNA ladder; Giếng 1, 2, 3,
4, 5 lần lượt tương ứng các nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 của B. cereus D1.7 và B. subtilis; Giếng 6: B. subtilis; Giếng 7: Nước.
M 1 2 3 4 5 6 7
500bp 500bp
Để xác định được sự hiện diện của B. cereus nói chung và B. cereus D1.7 trong nguồn thực phẩm thì dựa trên phương pháp truyền thống gồm phân lập, kiểm tra các đặc tính hóa sinh phải mất ít nhất 3 ngày. Trong khi thử nghiệm phát hiện B. cereus D1.7 trực tiếp từ thực phẩm giả định dựa vào kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu đang cho thấy khả năng rút ngắn thời gian phát hiện B. cereus
lên rất nhiều (3 giờ) cũng như khả năng áp dụng kỹ thuật này trong phát hiện B. cereus gây ngộ độc thực phẩm từ các nguồn thực phẩm ở Việt Nam. Tuy nhiên vẫn cần phát hiện thêm các gen độc tố của B. cereus trực tiếp từ thực phẩm giả định và thử nghiệm quy trình này để phát hiện các gen mã hóa độc tố của chúng trong một số thực phẩm để đưa ra kết luận cuối cùng.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ