4.1. PHÂN LẬP Bacillus cereus
Các mẫu đất, thực phẩm sau khi được thu thập sẽ tiến hành phân lập như nội dung phương pháp. Đĩa nuôi cấy được ủ ở 37oC trong vòng 24h sẽ xuất hiện một số loại khuẩn lạc khác nhau. Dựa vào một số đặc điểm hình thái đặc trưng của vi khuẩn nhóm B. cereus bao gồm khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc và mơi trường MPA, tế bào hình que xếp thành từng chuỗi, bắt màu nhuộm gram dương, sinh bào tử, chúng tôi đã chọn được 11 chủng phân lập tiêu biểu là C1.1, C1.3, CV1.6, B1.5 và D1.7, B1, B2, B3, B4, C, Đ. (Hình 4.1).
Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc chủng D1.7 khi phân lập trên môi trường
MYP (A) và trên môi trường MPA (B) sau 24h nuôi cấy ở 37oC.
Kết quả nhuộm Gram cho thấy 11 chủng trên có dạng hình que, bắt màu tím cho thấy các chủng này là trực khuẩn gram dương, là đặc điểm của các vi khuẩn thuộc nhóm B. cereus (hình 4.2A). Trong nhóm vi khuẩn B. cereus có 04 lồi bao gồm B. cereus, B. mycoides, B. thuringiensis, B. anthracis chúng mang rất nhiều các đặc điểm giống nhau vì vậy để xác định vi khuẩn B. cereus chúng tôi sẽ loại bỏ những chủng khác căn cứ vào những đặc điểm đặc trưng. Trên mơi trường chọn lọc, 11 chủng này có khuẩn lạc màu phớt hồng, xung quanh khuẩn lạc có vùng kết tủa màu hồng (hình 4.1A). Trên mơi trường cơ bản MPA, khuẩn lạc có hình trịn, đường kính khoảng 0,2-0,3cm, màu trắng sữa hoặc trắng đục, có tâm lồi, mép khơng có dạng răng cưa (hình 4.1B). Dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc có thể thấy cả 11 chủng phân lập khơng phải là vi khuẩn B. mycoides trong
A B
nhóm B. cereus do khuẩn lạc của B. mycoides có dạng rễ cây trong khi đó các
lồi cịn lại trong nhóm B. cereus đều khơng có đặc điểm này. Kết quả nhuộm
màu bằng fushin bazơ thể hiện bào tử bắt màu hồng nhạt, có dạng elip, nằm ở trung tâm tế bào, vi khuẩn khơng sinh tinh thể sau 03 ngày ni cấy (hình 4.3). Điều này cho thấy các chủng phân lập không phải là vi khuẩn B. thurigiensis,
một thành viên khác trong nhóm B. cereus do B. thuringienis có khả năng sinh
tinh thể độc bắt màu tím đậm. Để kiểm tra hình thái tế bào của các chủng phân lập một cách chi tiết hơn, chúng tơi đã tiến hành quan sát hình thái tế bào của các chủng phân lập dưới kính hiển vi điện tử. Các chủng phân lập có dạng hình que, xếp thành chuỗi, hai cực của tế bào trịn (hình 4.2B). Điều này cho thấy chúng khơng phải là vi khuẩn B. anthracis vì vi khuẩn này có điểm đặc trưng là đầu tế bào hơi vuông. Đánh giá sơ bộ đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào các chủng vi khuẩn phân lập được có thể xếp chúng vào nhóm vi khuẩn B. cereus tuy nhiên cần phải có những nghiên cứu tiếp theo để khẳng định kết quả này.
Hình 4.2. Hình thái tế bào của chủng D1.7 sau 24h nuôi cấy ở 37oC quan sát trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần (A) và trên kính hiển vi
điện tử quét ở độ phóng đại 13000 lần (B)
A B
Hình 4.3. Hình thái bào tử chủng phân lập C1.1 sau 3 ngày nuôi cấy ở 37oC trên kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần.
4.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỢC CHỌN LỌC CHỌN LỌC
Hình thái là một trong những đặc điểm quan trọng để xác định vi khuẩn B.
cereus tuy nhiên chưa thể kết luận chính xác có phải là hay khơng, vì thế chúng
tơi tiếp tục nghiên cứu các đặc điểm sinh học quan trọng đặc trưng đối với các chủng phân lập đã tuyển chọn.
4.2.1. Khả năng sinh Catalase
Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme catalase là khi bổ sung H2O2 30% vào môi trường nuôi cấy, chúng đều có khả năng chuyển hóa H2O2 thành H2O và O2 thể hiện qua hiện tượng sủi bọt khí với các cường độ khác nhau.
Hình 4.4. Khả năng sinh Catalase của 11 chủng phân lập. Lần lượt từ 1 đến 5 là C1.1, B1.5, D1.7, C1.3 và CV1.6 (hình 4.4A).
A
Kết quả cho thấy các chủng phân lập được đều có khả năng sinh enzyme catalase với các cường độ khác nhau. Ta nhận thấy chủng B1.5 có khả năng sinh enzyme catalase mạnh nhất và chủng C1.1 có khả năng sinh enzyme catalase là yếu nhất (hình 4.4).
4.2.2. Khả năng sinh axetoin (Phản ứng V-P)
Phản ứng V-P dựa trên sự oxi hóa axetoin (axetylmethylcacbinol AMC) từ 2,3-butanediol thành diaxetyl được minh họa qua các phản ứng như sau :
Glucozơ + ½ O2 → 2,3 butanediol + H2O + 2CO2
2,3-butanediol axetoin
Axetoin + α – naphtol diacetyl
Diacetyl + guanidine nucleus phức diacetyl - guanidin Thuốc thử ) (có màu đỏ hồng nhạt)
Hình
Hình 4.5. Khả năng sinh axetoin của 11 chủng nghiên cứu. Lần lượt từ 1 đến 5 là CV1.6, D1.7, C1.3, C1.1 và B1.5 (hình A).
Hình 4.5 cho thấy cả 11 chủng phân lập đều có khả năng làm biến đổi màu mơi trường thành màu hồng khi bổ sung thuốc thử, điều này cũng chứng tỏ 11 chủng phân lập có khả năng sinh axeton khá mạnh.
4.2.3. Khả năng sinh gelatinase
Các chủng tuyển chọn được nuôi cấy trên mơi trường có chứa gelatin (đơng đặc ở điều kiện lạnh), trong thời gian nuôi cấy chủng nào sinh ra gelatinase sẽ
2,3 butanediol dehydrogenase Oxi hóa
40% KOH O2 (Oxidized)
làm cho môi trường trở nên lỏng do gelatinase phân cắt gelatin thành các axit amin hịa tan vào mơi trường.
Hình 4.6. Khả năng sinh gelatinase của 11 chủng phân lập (Ống nghiệm để ngang) ngang)
Kết quả cho thấy cả 11 chủng đều có khả năng sinh gelatinase. Tuy nhiên có 2 chủng C1.3 và B1.5 thì khả năng sinh gelatinase cịn yếu (hình 4.6).
4.2.4. Khả năng phân giải thạch huyết
B. cereus có khả năng sinh haemolysin làm tan huyết là đặc điểm rất quan
trọng. Trong đó, haemolysin là một trong những độc tố quan trọng trong quá trình gây bệnh của B. cereus. Các chủng tuyển chọn được nuôi cấy trên môi
trường thạch máu cừu trong 24h, những chủng nào sinh haemolysin sẽ làm xuất hiện các vùng sáng xung quanh khuẩn lạc do chất này sinh ra làm cho các tế bào máu bị phân giải. Kết quả thử nghiệm cho thấy, trong 11 chủng phân lập thì chỉ có chủng D1.7, B1, B4, Đ có khả năng phân giải thạch huyết (hình 4.7).
Hình 4.7. Khả năng phân giải thạch huyết của các chủng phân lập
A B CV1.1 B1.5 D1.7 Đ B1 B4
Như vậy, 11 chủng B. cereus phân lập và tuyển chọn được trên môi trường chọn lọc và dựa trên hình thái khuẩn lạc, tế bào, bào tử đã được thu nhận và tiến hành nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy, các phản ứng sinh lý sinh hố để có thể so sánh chúng với các lồi cịn lại trong nhóm 1 chi Bacillus. Kết quả được tổng hợp ở bảng 4.1:
Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra một số đặc điểm sinh lý sinh hóa của các chủng phân lập của các chủng phân lập Đặc tính Các chủng phân lập C1.3 C1.1 CV1.6 B1.5 D1.7 C B1 B2 B3 B4 Đ Gram + + + + + + + + + + + Catalase + +/- + + + + + + + + + Sinh Gelatin +/- + + + + + + + + + + Phản ứng VP + + + + + + + + + + +
Tan máu (cừu) - - - - + - + - - + +
Chú thích: + : dương tính ; - : âm tính; +/-: dương tính, yếu;
Căn cứ vào các kết quả ở bảng 4.1, trong số 11 chủng phân lập đã tuyển chọn thì chủng D1.7, B1, B4, Đ có đặc tính giống với chủng B. cereus nhất. Do đó tơi chọn 1 trong số 4 chủng trên (chủng D1.7) cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.3. ĐỊNH DANH CHỦNG D1.7 BẰNG PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ 16S rDNA
Để định danh chủng D1.7 trước hết tôi tiến hành tách chiết ADN tổng số để làm khuôn. DNA tổng số từ chủng D1.7 được tách chiết theo mô tả trong nội dung phương pháp. Sử dụng DNA này làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen của vùng 16S rDNA, chúng tôi đã nhân được đoạn gen có kích thước khoảng 1,5kb tương ứng (hình 4.8).
Hình 4.8. Điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu trên gel agarose 1,2%. Giếng M: Marker O GeneRuler' TM 100bp DNA ladder; giếng 1:
Chủng D1.7
Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự. Tiến hành so sánh với các trình tự 16S khác trên GenBank nhờ công cụ blast, xây dựng cây phân loại cho chủng D1.7 (hình 4.9). Dựa vào cây phân loại này có thể thấy chủng D1.7 nằm cùng nhánh với B. cereus HN001, B. thuringinensis KNU07, B. thuringinensis
serovar coreanensis ST7 với giá trị bootstrap là 100. Bên cạnh đó, kết quả căn trình tự nucleotide cho thấy mức độ tương đồng của 16S rDNA của chủng D1.7 và 2 chủng trên là 99%. Xét về mặt giá trị tin cậy và mức độ tương đồng cho thấy D1.7 nằm cùng nhóm với 2 chủng trên.
Kết hợp các đặc điểm hình thái, sinh hóa và phương pháp sinh học phân tử, chúng tơi khẳng định D1.7 thuộc chủng B. cereus và đặt tên cho chủng này là B.
cereus D1.7.
~1500 bp
Hình 4.9. Cây phân loại dựa trên trình tự 16S rDNA của chủng vi khuẩn D1.7
4.4. PHÁT HIỆN GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ CỦA CHỦNG B. cereus D1.7
ADN tổng số đã tách chiết được ở trên được sử dụng làm khuôn cho phản ứng khuếch đại các gen mã hóa độc tố của B. cereus D1.7.
Hình 4.10. Điện di đồ sản phẩm PCR với các mồi NheA (A), HblA (B), HblD (C), Bcet (D), CytK (E), EntFM (F) trên gel agarose 1,5%. Giếng M: Marker
O GeneRuler' TM 1kb DNA ladder (C, E), Marker O GeneRuler' TM 100bp DNA ladder (A, B, D, F); Giếng 1: B. cereus D1.7; giếng 2: Đối chứng
âm: B. subtilis. 500bp 600bp 400bp 500bp M 1 2 400bp 500bp 300bp 300bp 500bp 1000bp 250bp 500bp M 1 2 500bp 600bp 400bp 400bp M 1 2 500bp 750bp 250bp 600bp M 1 2 1200bp 1500bp 1000bp 1300bp M 1 2 B C D E F
B. cereus gây ngộ độc thực phẩm với thể bệnh tiêu chảy do chúng có khả
năng sinh ra các độc tố ruột trong cơ chế gây bệnh. Trong các loại độc tố có liên quan tới các vụ ngộ độc gây tiêu chảy thì HBL, NHE là 2 loại độc tố phổ biến nhất. NHE có bản chất protein 3 thành phần, gồm các chuỗi A, B và C. Hoạt động của NHE mạnh nhất khi có đầy đủ cả 3 protein này. Các gen nheA, nheB, nheC lần lượt mã hoá cho 3 protein NHEA, NHEB, NHEC và 3 gen này cùng
nằm trên một operon.
Trong giới hạn của đề tài, tơi tiến hành phát hiện sự có mặt của gen nheA
của chủng B. cereus D1.7 phân lập được. Phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen
nheA có kích thước dự kiến 480bp.
Kết quả điện di ở hình 4.10A có sự xuất hiện của sản phẩm gen có kích thước khoảng 500bp, cho thấy chủng D1.7 có phản ứng đặc hiệu với mồi NheA mà tôi sử dụng và vi khuẩn đối chứng là B. subtilis có phản ứng âm tính. Như vậy có thể khẳng định chủng B. cereus D1.7 có mang gen mã hóa độc tố NHEA.
Phát hiện gen hblA và hblD (hình 4.10B và 4.10C)
B. cereus gây ngộ độc thực phẩm với thể bệnh tiêu chảy do chúng có khả
năng sinh ra các độc tố ruột trong cơ chế gây bệnh. Trong các loại độc tố có liên quan tới các vụ ngộ độc gây tiêu chảy thì HBL là loại độc tố phổ biến, HBL hoạt động mạnh nhất khi có cả 3 thành phần protein L2, L1, B. Các tiểu phần B, L1, L2 lần lượt được mã hóa bởi ba gen hblD, hblC, hblA.
Cặp mồi HblA khuếch đại vạch băng có kích thước 319bp được Hansen và Hendriksen (2000) sử dụng thành công trong việc phát hiện độc tố của chủng B. cereus F837/76. Jackson et al., 2008 đã sử dụng cặp mồi HblD khuếch đại vạch
băng 429bp.
Trong đề tài này, tơi tiến hành phát hiện sự có mặt của gen hblA, hblD của chủng B. cereus D1.7. Phản ứng PCR được tiến hành với cặp mồi HblA, HblD
với kích thước sản phẩm dự kiến lần lượt là 319bp và 429bp.
Kết quả điện di ở hình 4.10B và 4.10C lần lượt có sự xuất hiện của sản phẩm gen với kích thước khoảng 300bp và 500bp, cho thấy chủng D1.7 có phản ứng đặc hiệu với mồi HblA, HblD mà tôi sử dụng và vi khuẩn đối chứng là B. subtilis có phản ứng âm tính. Như vậy có thể khẳng định chủng B. cereus D1.7
có mang gen mã hóa thành phần B, L2 của độc tố HBL.
Phát hiện gen bceT (hình 4.10D)
tiêu chảy. Là độc tố có hoạt động sinh học tương tự như Nhe và có bản chất protein 1 thành phần. Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện độc tố T trong chủng
B. cereus D1.7 với cặp mồi BceT có kích thước sản phẩm dự kiến là 428bp.
Mồi BceT khuếch đại vạch băng có kích thước 428bp trong mẫu có gen (Agata et al., 1995). Mồi này được Graham Burgess và Paul Horwood sử dụng để phát hiện gen mã hóa hóa độc tố bc-D-ENT của chủng B. cereus có khả năng gây ngộ độc thực phẩm. Dựa theo cơng trình nghiên đã cứu đó và kết quả điện di ở hình 4.10D, có xuất hiện vạch băng có kích thước khoảng 400bp với chủng B. cereus D1.7 và có phản ứng âm tính với đối chứng âm B. subtilis. Vì vậy có thể
khẳng định rằng chủng B. cereus D1.7 có mang gen mã hóa độc tố bc-D-ENT.
Phát hiện gen cytK (hình 4.10E)
CytK là loại độc tố có khả năng gây tử vong cao hơn các loại độc tố khác của B. cereus. Theo Ngamwongsatit el al. (2008), gần 90% chủng B. cereus có
thể mang gen này. Trong đề tài này tơi tiến hành PCR với cặp mồi CytK với kích thước sản phẩm dự kiến là 605bp.
Cặp Mồi CytK khuếch đại vạch băng có kích thước 605bp (Lund và Cs 2000) đã được Graham Burgess và Paul Horwood sử dụng trong cơng trình nghiên cứu phát hiện gen mã hóa độc tố của vi khuẩn B. cereus gây ngộ độc thực phẩm. Qua kết quả điện di ở hình 4.10E và dựa vào cơng trình nghiên cứu có thể thấy rằng có xuất hiện vạch băng có kích thước khoảng 600bp với chủng B. cereus D1.7 và có phản ứng âm tính với chủng vi khuẩn đối chứng, chứng tỏ
rằng chủng B. cereus D1.7 có mang gen mã hóa độc tố CytK gây ngộ độc thực phẩm với thể bệnh tiêu chảy.
Phát hiện gen mã hóa độc tố entFM (hình 4.10F)
Độc tố FM (entFM) là độc tố có bản chất protein với vai trò và đặc tính chưa được biết đến. Bằng chứng cho sự tồn tại của một enterotoxin này của B. cereus lần đầu tiên được phát hiện bởi Granum et al. (1996). Các nghiên cứu tỷ
lệ cho thấy entFM được phát hiện ở hầu hết các chủng liên quan đến sự bùng phát dịch bệnh. Graham Burgess và Paul Horwood đã sử dụng cặp mồi entFM khuếch đại đoạn gen mã hóa độc tố entFM có kích thước là 1269bp [12].
Trong đề tài này tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi entFM với kích thước sản phẩm dự kiến là 1269bp. Qua hình ảnh điện di 4.10F có thể thấy rằng có xuất hiện vạch băng có kích thước khoảng 1300bp với chủng B. cereus D1.7 và có phản ứng âm tính với chủng vi khuẩn đối chứng, chứng tỏ
rằng chủng B. cereus D1.7 có mang gen mã hóa độc tố EntFM gây ngộ độc thực phẩm với thể bệnh tiêu chảy.
Ngộ độc thực phẩm do B. cereus là một mối quan tâm lớn trên toàn thế giới [35]. Do đó, các phương pháp đơn giản, nhanh chóng để phát hiện các tế bào thuộc chủng B. cereus trong các mẫu thực phẩm là rất quan trọng. Vì vậy, tơi
muốn xây dựng một phương pháp đáng tin cậy cho việc xác định nhanh sự có mặt của B. cereus có khả năng gây ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam.
Kỹ thuật PCR được cho là nhanh và đơn giản để nhận biết thực phẩm có khả năng gây ngộ độc thực phẩm do các độc tố từ B. cereus [35]. Hansen et al. (2001) đã sử dụng cặp mồi đặc hiệu để phát hiện trình tự 16S rDNA đặc trưng cho nhóm B. cereus. Nooratiny, I. and Sahilah, A. M (2013) đã sử dụng kỹ thuật này để phát hiện gen entFM và hblA mã hóa độc tố của B. cereus BC1. Monika Ehling – Schulz et al. (2006) đã sử dụng kỹ thuật này để phát hiện các gen mã hóa độc tố HBL, NHE, cytK.
Trong nghiên cứu này tôi đã dùng kỹ thuật PCR để phát hiện thành công các gen hblA, hblD, nheA, cytK, entFM mã hóa độc tố hoặc một trong các thành