Phần 3 Vật liệu và phương pháp
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.6. Phát hiện B.cereus chứa gen mã hóa độc tố trên thực phẩm giả định
Bước 1: Chuẩn bị thực phẩm sạch
Mẫu cơm vừa nấu chín được kiểm tra khơng bị nhiễm B. cereus bằng kỹ
thuật PCR trước khi gây nhiễm thực nghiệm:
1/ Cân 25g cơm cho vào bình chứa 225ml mơi trường làm giàu mẫu. Sau 15 – 24h làm giàu mẫu ở 37ºC, lấy 1ml dịch làm giàu tách chiết ADN (tương tự phần 2.2.3).
2/ Khuếch đại trình tự các gen mã hóa độc tố của B. cereus (tương tự bước 2 phần 3.2.4).
Nếu trên kết quả điện di khơng xuất hiện vạch băng thì mẫu cơm sử dụng là mẫu sạch.
Bước 2: Chuẩn bị B. cereus
Nuôi cấy và xác định nồng độ vi khuẩn B. cereus gây nhiễm được tiến hành như bước 1 của phần 3.2.5.
Bước 3: Gây nhiễm thực phẩm
Lấy 10g thực phẩm sạch ở trên trộn với 9800 µl nước khử ion và 100µl huyền dịch vi khuẩn B. subtilis có nồng độ vi khuẩn là 108 vi khuẩn/ml huyền dịch.
Lấy 100µl huyền dịch vi khuẩn B. cereus ở các nồng độ pha loãng 100; 10-1; 10-2; 10-3 lần lượt trộn vào hỗn hợp trên thu được các nồng độ vi khuẩn pha loãng 10-2; 10-3; 10-4; 10-5; 10-6.
Bước 4: Khuếch đại trình tự gen hblD bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc
hiệu.
Lượng vi khuẩn B. cereus đã được gây nhiễm ở 5 nồng độ pha loãng 10- 2;10-3; 10-4; 10-5; 10-6 được sử dụng để tiến hành các phản ứng PCR với cặp mồi HblD.
Thành phần phản ứng PCR:
Tế bào mẫu 2,0 µl Nước khử ion 6,0 µl Master mix 10 µl Mồi 1,0 µl