Phần 3 Vật liệu và phương pháp
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.3. Định danh chủng vi khuẩn
Căn cứ vào đặc điểm hình thái và hóa sinh. So sánh các đặc điểm này với các chủng vi khuẩn đã biết trong hệ thống phân loại quốc tế.
Căn cứ vào phân tích trình tự 16S rDNA. Phương pháp phân tích trình tự 16S rDNA:
1/ Dịch vi khuẩn nuôi cấy 24h trong 10ml môi trường MPB ở 30oC, lắc 150v/p
2/ Bổ sung 1ml dịch nuôi cấy vào ống eppdendofd 3/ Ly tâm 7000v/p 10 phút, lấy cặn
4/ Bổ sung 200µl nước khử ion, hịa tan cặn 5/ Đun ở 100oC 10 phút, ly tâm lấy dịch nổi 6/ Hút 100µl dịch nổi sang ống mới
7/ Bổ sung 100µl isopropanol 8/ Ly tâm 12000v/p 20 phút, lấy cặn
9/ Hịa tan cặn bằng 30µl nước khử hoặc TE giữ ở -20 oC Bước 2: Khuếch đại trình tự 16S rDNA bằng phản ứng PCR
DNA sau khi tách chiết xong được sử dụng để tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi có trình tự:
R: 5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’ F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ Thành phần phản ứng PCR :
ADN mẫu 2,0 µl Nước khử ion 6,0 µl Master mix 10 µl Mồi 1,0 µl
Bảng 3.2. Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi nhân gen 16S rDNA
Nhiệt độ (oC) 94 94 43 72 72
Giữ mẫu ở 4oC Thời gian 5 phút 15 giây 45 giây 2 phút 10 phút
Chu kỳ 1 30 1
Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,2%, sau đó gửi đi đọc trình tự tại cơng ty 1stBASE (Singapore). Mức độ tương đồng về trình tự gen mã hóa 16S rDNA của chủng nghiên cứu được so sánh với các chủng đã công bố trên Genbank sử dụng công cụ tra cứu Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Sử dụng phần mềm MEGA7 để xây dựng cây xác định mối quan hệ di truyền, lựa chọn phương pháp bio-joining
với độ tin cậy được tính bằng thuật tốn Bootstrap với 1000 lần lặp lại. Dựa vào cây phân loại và giá trị bootstrap để xác định mối quan hệ di truyền của chủng nghiên cứu.