Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.6. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu về Bacillus cereus
CỨU VỀ Bacillus cereus
2.6.1. Kỹ thuật PCR
Trên thế giới, các kỹ thuật PCR đã được sử dụng để phát hiện các gen đặc hiệu của B. cereus trong thực phẩm [8,24]. Kỹ thuật PCR không chỉ giảm thời gian phát hiện B. cereus trong các mẫu thực phẩm, mà cịn có thể phát
hiện được một cách chính xác các chủng B. cereus này có khả năng sinh ra các độc tố hay không. Jackson N.Ombui et al. (2008) đã sử dụng phương pháp
Multiplex – PCR để xác định giới hạn lượng B. cereus có thể phát hiện trong một số loại thực phẩm.
Nghiên cứu xây dựng qui trình phát hiện gen độc tố ruột của B. cereus trong thực phẩm bằng kỹ thuật multiplex PCR là vấn đề cần thiết. Nó khơng những giải quyết việc xác định nhanh các độc tố ruột của B. cereus, giúp các bác sĩ lâm sàng và dịch tễ có các biện pháp xử lý và điều trị kịp thời, mà còn là tiền đề để phát triển kỹ thuật PCR trong xác định trực tiếp các căn nguyên khác gây ngộ độc thực phẩm. Có hai loại phản ứng PCR :
+ PCR đơn thực hiện với một cặp mồi duy nhất.
+ PCR đa mồi (Multiplex – PCR) thực hiện với nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng.
PCR đơn là một phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhưng do B. cereus gây bệnh bằng cách sinh độc tố nên nếu sử dụng phương pháp PCR đơn thì sẽ tốn nhiều thời gian và nguyên vật liệu hơn so với phương pháp PCR đa mồi vì B. cereus có thể sinh ra 6 loại độc tố khác nhau. Phương pháp PCR đa mồi phát hiện được nhiều tác nhân gây bệnh chỉ bằng một phản ứng PCR nên tiết kiệm nguyên vật liệu và thời gian đồng thời có độ nhạy và độ đặc hiệu khơng kém gì phương pháp PCR đơn mồi.
Tuy nhiên sự có mặt của một số chất trong thực phẩm như một lượng lớn ADN không phải từ B. cereus sẽ ức chế phản ứng PCR, làm giảm đáng kể độ
nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật. Vấn đề đặt ra ở đây là làm sao tách chiết được ADN của các độc tố ruột của B. cereus trực tiếp từ bệnh phẩm.
Đã có một số phương pháp tách chiết DNA trực tiếp từ thực phẩm như: phương pháp sử dụng nhiệt độ, sử dụng ethanol...
Hiện nay trên thị trường có một số bộ kit thương phẩm như bộ sinh phẩm của hãng QIAGEN. Tuy nhiên phương pháp này quá phức tạp, quá đắt và chỉ thực hiện được ở những phòng xét nghiệm được trang bị máy móc hiện đại.Vì thế, một phương pháp tách chiết DNA trực tiếp từ thực phẩm đơn giản, nhanh, hiệu quả và ít tốn kém sẽ có ý nghĩa vơ cùng quan trọng trong điều kiện của Việt Nam, là chìa khố đối với kỹ thuật Multiplex – PCR, xác định trực tiếp các độc tố gây ngộ độc thực phẩm của B. cereus từ thực phẩm.
2.6.2. Giải mã trình tự gen (Sequencing)
Hiện nay các nhà khoa học đã ứng dụng kỹ thuật giải mã để giải mã trình tự của các gen HblA, HblB và HblC mã hóa các protein ly giải hồng cầu HBL, các gen NheA, NheB, NheC mã hóa các protein nội độc tố không gây ly giải hồng
cầu, gen CytK mã hóa độc tố tế bào K [36].
2.6.3. Kỹ thuật khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn DNA đa hình (RAPD)
Kỹ thuật RAPD lần đầu tiên được phát hiện bởi Williams và cộng sự năm 1990 trên cơ sở kỹ thuật PCR. Khác với kỹ thuật PCR thông thường thường sử dụng các đoạn mồi bổ sung cho các trình tự đã biết, RAPD chỉ sử dụng các mồi oligonucleotid được tổng hợp ngẫu nhiên từ 9 đến 12 base. Như vậy, RAPD cho phép phát hiện tính đa hình mà khơng cần biết trước một trình tự nucleotide nhất định. Tính đa hình này có thể sử dụng làm marker phân tử hoặc dùng để lập bản đồ gen. Ron S. Ronimus et al. (1996) đã sử dụng phương pháp RAPD để xác
định Bacillus trong các thực phẩm cơng nghiệp bị nhiễm.
Ưu điểm : Có độ nhạy và độ đặc hiệu cao khi phân biệt các loài khác nhau. Nhược điểm: Phương pháp này rất nhạy cảm với điều kiện phản ứng như
chất lượng DNA, nồng độ muối ví dụ Mg2+ và tỷ lệ giữa mồi và đoạn mẫu (template) và vì thế các kết quả khơng phải ln trước sau như một.
2.6.4. Kỹ thuật RFLP (Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn)
RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình DNA bằng cách kết hợp kỹ thuật PCR và phản ứng cắt của enzyme giới hạn (Restriction Enzyme, RE).
Ưu điểm: Đây là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử có độ đặc hiệu
và độ nhậy cao cho phép xác định nhanh chóng và chính xác sự có mặt của không chỉ một lồi vi khuẩn mà cịn cho phép xác định và phân biệt nhiều loài vi khuẩn.
Nhược điểm: Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với
sức khoẻ người nghiên cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu), và DNA yêu cầu có chất lượng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này.