A B CV1.1 B1.5 D1.7 Đ B1 B4
Như vậy, 11 chủng B. cereus phân lập và tuyển chọn được trên môi trường chọn lọc và dựa trên hình thái khuẩn lạc, tế bào, bào tử đã được thu nhận và tiến hành nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy, các phản ứng sinh lý sinh hố để có thể so sánh chúng với các lồi cịn lại trong nhóm 1 chi Bacillus. Kết quả được tổng hợp ở bảng 4.1:
Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra một số đặc điểm sinh lý sinh hóa của các chủng phân lập của các chủng phân lập Đặc tính Các chủng phân lập C1.3 C1.1 CV1.6 B1.5 D1.7 C B1 B2 B3 B4 Đ Gram + + + + + + + + + + + Catalase + +/- + + + + + + + + + Sinh Gelatin +/- + + + + + + + + + + Phản ứng VP + + + + + + + + + + +
Tan máu (cừu) - - - - + - + - - + +
Chú thích: + : dương tính ; - : âm tính; +/-: dương tính, yếu;
Căn cứ vào các kết quả ở bảng 4.1, trong số 11 chủng phân lập đã tuyển chọn thì chủng D1.7, B1, B4, Đ có đặc tính giống với chủng B. cereus nhất. Do đó tơi chọn 1 trong số 4 chủng trên (chủng D1.7) cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.3. ĐỊNH DANH CHỦNG D1.7 BẰNG PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ 16S rDNA
Để định danh chủng D1.7 trước hết tôi tiến hành tách chiết ADN tổng số để làm khuôn. DNA tổng số từ chủng D1.7 được tách chiết theo mô tả trong nội dung phương pháp. Sử dụng DNA này làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen của vùng 16S rDNA, chúng tôi đã nhân được đoạn gen có kích thước khoảng 1,5kb tương ứng (hình 4.8).
Hình 4.8. Điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu trên gel agarose 1,2%. Giếng M: Marker O GeneRuler' TM 100bp DNA ladder; giếng 1:
Chủng D1.7
Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự. Tiến hành so sánh với các trình tự 16S khác trên GenBank nhờ công cụ blast, xây dựng cây phân loại cho chủng D1.7 (hình 4.9). Dựa vào cây phân loại này có thể thấy chủng D1.7 nằm cùng nhánh với B. cereus HN001, B. thuringinensis KNU07, B. thuringinensis
serovar coreanensis ST7 với giá trị bootstrap là 100. Bên cạnh đó, kết quả căn trình tự nucleotide cho thấy mức độ tương đồng của 16S rDNA của chủng D1.7 và 2 chủng trên là 99%. Xét về mặt giá trị tin cậy và mức độ tương đồng cho thấy D1.7 nằm cùng nhóm với 2 chủng trên.
Kết hợp các đặc điểm hình thái, sinh hóa và phương pháp sinh học phân tử, chúng tôi khẳng định D1.7 thuộc chủng B. cereus và đặt tên cho chủng này là B.
cereus D1.7.
~1500 bp
Hình 4.9. Cây phân loại dựa trên trình tự 16S rDNA của chủng vi khuẩn D1.7
4.4. PHÁT HIỆN GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ CỦA CHỦNG B. cereus D1.7
ADN tổng số đã tách chiết được ở trên được sử dụng làm khn cho phản ứng khuếch đại các gen mã hóa độc tố của B. cereus D1.7.
Hình 4.10. Điện di đồ sản phẩm PCR với các mồi NheA (A), HblA (B), HblD (C), Bcet (D), CytK (E), EntFM (F) trên gel agarose 1,5%. Giếng M: Marker
O GeneRuler' TM 1kb DNA ladder (C, E), Marker O GeneRuler' TM 100bp DNA ladder (A, B, D, F); Giếng 1: B. cereus D1.7; giếng 2: Đối chứng
âm: B. subtilis. 500bp 600bp 400bp 500bp M 1 2 400bp 500bp 300bp 300bp 500bp 1000bp 250bp 500bp M 1 2 500bp 600bp 400bp 400bp M 1 2 500bp 750bp 250bp 600bp M 1 2 1200bp 1500bp 1000bp 1300bp M 1 2 B C D E F
B. cereus gây ngộ độc thực phẩm với thể bệnh tiêu chảy do chúng có khả
năng sinh ra các độc tố ruột trong cơ chế gây bệnh. Trong các loại độc tố có liên quan tới các vụ ngộ độc gây tiêu chảy thì HBL, NHE là 2 loại độc tố phổ biến nhất. NHE có bản chất protein 3 thành phần, gồm các chuỗi A, B và C. Hoạt động của NHE mạnh nhất khi có đầy đủ cả 3 protein này. Các gen nheA, nheB, nheC lần lượt mã hoá cho 3 protein NHEA, NHEB, NHEC và 3 gen này cùng
nằm trên một operon.
Trong giới hạn của đề tài, tôi tiến hành phát hiện sự có mặt của gen nheA
của chủng B. cereus D1.7 phân lập được. Phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen
nheA có kích thước dự kiến 480bp.
Kết quả điện di ở hình 4.10A có sự xuất hiện của sản phẩm gen có kích thước khoảng 500bp, cho thấy chủng D1.7 có phản ứng đặc hiệu với mồi NheA mà tôi sử dụng và vi khuẩn đối chứng là B. subtilis có phản ứng âm tính. Như vậy có thể khẳng định chủng B. cereus D1.7 có mang gen mã hóa độc tố NHEA.
Phát hiện gen hblA và hblD (hình 4.10B và 4.10C)
B. cereus gây ngộ độc thực phẩm với thể bệnh tiêu chảy do chúng có khả
năng sinh ra các độc tố ruột trong cơ chế gây bệnh. Trong các loại độc tố có liên quan tới các vụ ngộ độc gây tiêu chảy thì HBL là loại độc tố phổ biến, HBL hoạt động mạnh nhất khi có cả 3 thành phần protein L2, L1, B. Các tiểu phần B, L1, L2 lần lượt được mã hóa bởi ba gen hblD, hblC, hblA.
Cặp mồi HblA khuếch đại vạch băng có kích thước 319bp được Hansen và Hendriksen (2000) sử dụng thành công trong việc phát hiện độc tố của chủng B. cereus F837/76. Jackson et al., 2008 đã sử dụng cặp mồi HblD khuếch đại vạch
băng 429bp.
Trong đề tài này, tôi tiến hành phát hiện sự có mặt của gen hblA, hblD của chủng B. cereus D1.7. Phản ứng PCR được tiến hành với cặp mồi HblA, HblD
với kích thước sản phẩm dự kiến lần lượt là 319bp và 429bp.
Kết quả điện di ở hình 4.10B và 4.10C lần lượt có sự xuất hiện của sản phẩm gen với kích thước khoảng 300bp và 500bp, cho thấy chủng D1.7 có phản ứng đặc hiệu với mồi HblA, HblD mà tôi sử dụng và vi khuẩn đối chứng là B. subtilis có phản ứng âm tính. Như vậy có thể khẳng định chủng B. cereus D1.7
có mang gen mã hóa thành phần B, L2 của độc tố HBL.
Phát hiện gen bceT (hình 4.10D)
tiêu chảy. Là độc tố có hoạt động sinh học tương tự như Nhe và có bản chất protein 1 thành phần. Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện độc tố T trong chủng
B. cereus D1.7 với cặp mồi BceT có kích thước sản phẩm dự kiến là 428bp.
Mồi BceT khuếch đại vạch băng có kích thước 428bp trong mẫu có gen (Agata et al., 1995). Mồi này được Graham Burgess và Paul Horwood sử dụng để phát hiện gen mã hóa hóa độc tố bc-D-ENT của chủng B. cereus có khả năng gây ngộ độc thực phẩm. Dựa theo cơng trình nghiên đã cứu đó và kết quả điện di ở hình 4.10D, có xuất hiện vạch băng có kích thước khoảng 400bp với chủng B. cereus D1.7 và có phản ứng âm tính với đối chứng âm B. subtilis. Vì vậy có thể
khẳng định rằng chủng B. cereus D1.7 có mang gen mã hóa độc tố bc-D-ENT.
Phát hiện gen cytK (hình 4.10E)
CytK là loại độc tố có khả năng gây tử vong cao hơn các loại độc tố khác của B. cereus. Theo Ngamwongsatit el al. (2008), gần 90% chủng B. cereus có
thể mang gen này. Trong đề tài này tơi tiến hành PCR với cặp mồi CytK với kích thước sản phẩm dự kiến là 605bp.
Cặp Mồi CytK khuếch đại vạch băng có kích thước 605bp (Lund và Cs 2000) đã được Graham Burgess và Paul Horwood sử dụng trong cơng trình nghiên cứu phát hiện gen mã hóa độc tố của vi khuẩn B. cereus gây ngộ độc thực phẩm. Qua kết quả điện di ở hình 4.10E và dựa vào cơng trình nghiên cứu có thể thấy rằng có xuất hiện vạch băng có kích thước khoảng 600bp với chủng B. cereus D1.7 và có phản ứng âm tính với chủng vi khuẩn đối chứng, chứng tỏ
rằng chủng B. cereus D1.7 có mang gen mã hóa độc tố CytK gây ngộ độc thực phẩm với thể bệnh tiêu chảy.
Phát hiện gen mã hóa độc tố entFM (hình 4.10F)
Độc tố FM (entFM) là độc tố có bản chất protein với vai trị và đặc tính chưa được biết đến. Bằng chứng cho sự tồn tại của một enterotoxin này của B. cereus lần đầu tiên được phát hiện bởi Granum et al. (1996). Các nghiên cứu tỷ
lệ cho thấy entFM được phát hiện ở hầu hết các chủng liên quan đến sự bùng phát dịch bệnh. Graham Burgess và Paul Horwood đã sử dụng cặp mồi entFM khuếch đại đoạn gen mã hóa độc tố entFM có kích thước là 1269bp [12].
Trong đề tài này tơi tiến hành thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi entFM với kích thước sản phẩm dự kiến là 1269bp. Qua hình ảnh điện di 4.10F có thể thấy rằng có xuất hiện vạch băng có kích thước khoảng 1300bp với chủng B. cereus D1.7 và có phản ứng âm tính với chủng vi khuẩn đối chứng, chứng tỏ
rằng chủng B. cereus D1.7 có mang gen mã hóa độc tố EntFM gây ngộ độc thực phẩm với thể bệnh tiêu chảy.
Ngộ độc thực phẩm do B. cereus là một mối quan tâm lớn trên toàn thế giới [35]. Do đó, các phương pháp đơn giản, nhanh chóng để phát hiện các tế bào thuộc chủng B. cereus trong các mẫu thực phẩm là rất quan trọng. Vì vậy, tơi
muốn xây dựng một phương pháp đáng tin cậy cho việc xác định nhanh sự có mặt của B. cereus có khả năng gây ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam.
Kỹ thuật PCR được cho là nhanh và đơn giản để nhận biết thực phẩm có khả năng gây ngộ độc thực phẩm do các độc tố từ B. cereus [35]. Hansen et al. (2001) đã sử dụng cặp mồi đặc hiệu để phát hiện trình tự 16S rDNA đặc trưng cho nhóm B. cereus. Nooratiny, I. and Sahilah, A. M (2013) đã sử dụng kỹ thuật này để phát hiện gen entFM và hblA mã hóa độc tố của B. cereus BC1. Monika Ehling – Schulz et al. (2006) đã sử dụng kỹ thuật này để phát hiện các gen mã hóa độc tố HBL, NHE, cytK.
Trong nghiên cứu này tôi đã dùng kỹ thuật PCR để phát hiện thành công các gen hblA, hblD, nheA, cytK, entFM mã hóa độc tố hoặc một trong các thành phần độc tố gây ngộ độc thực phẩm của B. cereus trong thời gian (4-5 giờ) ngắn hơn so với phương pháp truyền thống (ít nhất 3 ngày). Đây là một bằng chứng cho thấy kỹ thuật này là nhanh chóng và đơn giản để nhận biết thực phẩm có khả năng gây ngộ độc do B. cereus ở Việt Nam.
4.5. XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY CỦA PHẢN ỨNG PCR
Độ nhạy của phản ứng là giới hạn phát hiện của phản ứng. Đó chính là nồng độ vi khuẩn (hoặc nồng độ DNA) tối thiểu mà phương pháp có thể phát hiện được. Nooratiny, I. and Sahilah, A. M (2013) đã sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện gen entFM và hblA mã hóa độc tố của B. cereus BC1. Giới hạn phát hiện
của cả 2 gen này là 0.1 ng DNA [35].
Để xác định độ nhạy của phản ứng, tôi đã tiến hành định lượng vi khuẩn/ml ban đầu là 3,5x108 vi khuẩn/ml. Lượng vi khuẩn này được pha loãng bậc 10 tới nồng độ pha loãng 10-6 và được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR với 5 cặp mồi rồi chạy điện di trên gel agarose 1,5%. Kết quả điện di đối với cả 5 cặp mồi này (hình 4.11) cho thấy ở các nồng độ pha loãng vi khuẩn từ 10-1 đến 10-5, xuất hiện các vạch gọn, bờ đều, phân tách rõ ràng.
Điều này chứng tỏ có thể sử dụng phương pháp PCR để phát hiện gen độc tố của B. cereus và lượng vi khuẩn B. cereus D1.7 tối thiểu để có thể phát hiện
gen độc tố của B. cereus bằng phương pháp PCR là 3,5x103 vi khuẩn/ml.
Hình 4.11. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi HblA (A), HblD (B), BceT (C), CytK (D), EntFM (E) trên gel agarose 1,5%. Giếng M: Marker O GeneRuler' TM 1kb DNA ladder (B, D); Marker O GeneRuler' TM 100bp DNA ladder (A, C, E); Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6 lần lượt tương ứng các nồng độ
pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 của B. cereus D1.7.
M 1 2 3 4 5 6 500bp 300bp 500bp 500bp M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6 500bp 400bp M 1 2 3 4 5 6 500bp 600bp M 1 2 3 4 5 6 500bp 1300bp A B C D E
4.6. PHÁT HIỆN Bacillus cereus CHỨA GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ TRÊN
THỰC PHẨM GIẢ ĐỊNH
Nooratiny, I. and Sahilah, A. M (2013) đã sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện gen entFM và hblA mã hóa độc tố của B. cereus BC1 trên một số thực phẩm giả định tại nồng độ DNA thấp nhất là 0.1 ng/µl. Yang et al. (2005), Omboi et al. (2008) cũng đã phát hiện trực tiếp một số gen mã hóa độc tố của B. cereus trên
thực phẩm giả định bằng cách sử dụng multiplex PCR [35].
Trong nghiên cứu này, tôi tiến hành gây nhiễm thực nghiệm bằng cách trộn huyền phù vi khuẩn B. cereus và 1 loại vi khuẩn khác là B. subtilis đã biết trước nồng độ với thực phẩm sạch rồi sau đó tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi HblD.
Kết quả điện di ở hình 4.12 cho thấy ở các nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-
4, 10-5 của vi khuẩn B. cereus xuất hiện các vạch gọn, bờ đều, phân tách rõ ràng. Điều này chứng tỏ có thể sử dụng phương pháp PCR để phát hiện gen mã hóa chuỗi L2 của độc tố HBL của B. cereus trực tiếp từ thực phẩm giả định tại nồng độ vi khuẩn 3,5x103 vi khuẩn/ml.
Hình 4.12. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi HblD trên gel agarose 1,5%. Giếng M: Marker O GeneRuler' TM 100bp plus DNA ladder; Giếng 1, 2, 3,
4, 5 lần lượt tương ứng các nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 của B. cereus D1.7 và B. subtilis; Giếng 6: B. subtilis; Giếng 7: Nước.
M 1 2 3 4 5 6 7
500bp 500bp
Để xác định được sự hiện diện của B. cereus nói chung và B. cereus D1.7
trong nguồn thực phẩm thì dựa trên phương pháp truyền thống gồm phân lập, kiểm tra các đặc tính hóa sinh phải mất ít nhất 3 ngày. Trong khi thử nghiệm phát hiện B. cereus D1.7 trực tiếp từ thực phẩm giả định dựa vào kỹ thuật PCR với
cặp mồi đặc hiệu đang cho thấy khả năng rút ngắn thời gian phát hiện B. cereus lên rất nhiều (3 giờ) cũng như khả năng áp dụng kỹ thuật này trong phát hiện B. cereus gây ngộ độc thực phẩm từ các nguồn thực phẩm ở Việt Nam. Tuy nhiên
vẫn cần phát hiện thêm các gen độc tố của B. cereus trực tiếp từ thực phẩm giả
định và thử nghiệm quy trình này để phát hiện các gen mã hóa độc tố của chúng trong một số thực phẩm để đưa ra kết luận cuối cùng.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
Đã xác định được 1 chủng vi khuẩn phân lập thuộc loài B. cereus dựa trên đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân tích trình tự 16S rDNA.
Đã phát hiện được 6 gen mã hóa độc tố gây ngộ độc thực phẩm ở chủng B.
cereus D1.7 được phân lập nhờ sử dụng kỹ thuật PCR.
Đã xác định được độ nhạy của phản ứng PCR trong phát hiện gen mã hóa độc tố gây ngộ độc thực phẩm của B. cereus D1.7 là 3,5x103 vi khuẩn/ml.
Đã sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện gen hblD của B. cereus D1.7 trực
tiếp từ thực phẩm giả định tại nồng độ 3,5x103 vi khuẩn/ml.
5.2. ĐỀ NGHỊ
Trên đây là một số kết quả về phát hiện gen độc tố của của vi khuẩn B. cereus, do vậy cần có những nghiên cứu tiếp theo hồn thiện hơn.
- Tiến hành phát hiện gen mã hoá độc tố HBLD, HBLA, cytK, bc-D-ENT của B. cereus D1.7 trên thực phẩm giả định.
- Thử nghiệm quy trình để phát hiện các gen mã hóa độc tố của B. cereus
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt:
1. Bùi Mạnh Hà (2006). Thống kê ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam. Truy cập ngày 10/12/2016 tại http://trungtamnghiencuuthucpham.vn/thong-ke-ngo-doc-thuc-pham- tai-viet-nam/
2. Duy Phan (2016). 15 loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm thường gặp nhất. Truy cập ngày 10/12/2016 http://www.baomoi.com/15-loai-vi-khuan-gay-ngo-doc-thuc- pham-thuong-gap-nhat/c/20108041.epi
3. Ngơ Đình Bính, Nguyễn Xuân Cảnh, Phạm Kiều Thuý, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Nguyễn Thanh Hạnh (2005). Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn Bacillus cereus phân lập ở Việt Nam. Báo cáo khoa học Hội nghị về Vệ sinh an toàn thực phẩm, tháng 11- 2005. Tr. 120-125.
4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003). Vi sinh vật học. Nhà