ADN tổng số đã tách chiết được ở trên được sử dụng làm khuôn cho phản ứng khuếch đại các gen mã hóa độc tố của B. cereus D1.7.
Hình 4.10. Điện di đồ sản phẩm PCR với các mồi NheA (A), HblA (B), HblD (C), Bcet (D), CytK (E), EntFM (F) trên gel agarose 1,5%. Giếng M: Marker
O GeneRuler' TM 1kb DNA ladder (C, E), Marker O GeneRuler' TM 100bp DNA ladder (A, B, D, F); Giếng 1: B. cereus D1.7; giếng 2: Đối chứng
âm: B. subtilis. 500bp 600bp 400bp 500bp M 1 2 400bp 500bp 300bp 300bp 500bp 1000bp 250bp 500bp M 1 2 500bp 600bp 400bp 400bp M 1 2 500bp 750bp 250bp 600bp M 1 2 1200bp 1500bp 1000bp 1300bp M 1 2 B C D E F
B. cereus gây ngộ độc thực phẩm với thể bệnh tiêu chảy do chúng có khả năng sinh ra các độc tố ruột trong cơ chế gây bệnh. Trong các loại độc tố có liên quan tới các vụ ngộ độc gây tiêu chảy thì HBL, NHE là 2 loại độc tố phổ biến nhất. NHE có bản chất protein 3 thành phần, gồm các chuỗi A, B và C. Hoạt động của NHE mạnh nhất khi có đầy đủ cả 3 protein này. Các gen nheA, nheB, nheC lần lượt mã hoá cho 3 protein NHEA, NHEB, NHEC và 3 gen này cùng nằm trên một operon.
Trong giới hạn của đề tài, tôi tiến hành phát hiện sự có mặt của gen nheA
của chủng B. cereus D1.7 phân lập được. Phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen
nheA có kích thước dự kiến 480bp.
Kết quả điện di ở hình 4.10A có sự xuất hiện của sản phẩm gen có kích thước khoảng 500bp, cho thấy chủng D1.7 có phản ứng đặc hiệu với mồi NheA mà tôi sử dụng và vi khuẩn đối chứng là B. subtilis có phản ứng âm tính. Như vậy có thể khẳng định chủng B. cereus D1.7 có mang gen mã hóa độc tố NHEA.
Phát hiện gen hblA và hblD (hình 4.10B và 4.10C)
B. cereus gây ngộ độc thực phẩm với thể bệnh tiêu chảy do chúng có khả năng sinh ra các độc tố ruột trong cơ chế gây bệnh. Trong các loại độc tố có liên quan tới các vụ ngộ độc gây tiêu chảy thì HBL là loại độc tố phổ biến, HBL hoạt động mạnh nhất khi có cả 3 thành phần protein L2, L1, B. Các tiểu phần B, L1, L2 lần lượt được mã hóa bởi ba gen hblD,hblC, hblA.
Cặp mồi HblA khuếch đại vạch băng có kích thước 319bp được Hansen và Hendriksen (2000) sử dụng thành công trong việc phát hiện độc tố của chủng B. cereus F837/76. Jackson et al., 2008 đã sử dụng cặp mồi HblD khuếch đại vạch băng 429bp.
Trong đề tài này, tôi tiến hành phát hiện sự có mặt của gen hblA, hblD của chủng B. cereus D1.7. Phản ứng PCR được tiến hành với cặp mồi HblA, HblD với kích thước sản phẩm dự kiến lần lượt là 319bp và 429bp.
Kết quả điện di ở hình 4.10B và 4.10C lần lượt có sự xuất hiện của sản phẩm gen với kích thước khoảng 300bp và 500bp, cho thấy chủng D1.7 có phản ứng đặc hiệu với mồi HblA, HblD mà tôi sử dụng và vi khuẩn đối chứng là B. subtilis có phản ứng âm tính. Như vậy có thể khẳng định chủng B. cereus D1.7 có mang gen mã hóa thành phần B, L2 của độc tố HBL.
Phát hiện gen bceT (hình 4.10D)
tiêu chảy. Là độc tố có hoạt động sinh học tương tự như Nhe và có bản chất protein 1 thành phần. Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện độc tố T trong chủng
B. cereus D1.7 với cặp mồi BceT có kích thước sản phẩm dự kiến là 428bp.
Mồi BceT khuếch đại vạch băng có kích thước 428bp trong mẫu có gen (Agata et al., 1995). Mồi này được Graham Burgess và Paul Horwood sử dụng để phát hiện gen mã hóa hóa độc tố bc-D-ENT của chủng B. cereus có khả năng gây ngộ độc thực phẩm. Dựa theo công trình nghiên đã cứu đó và kết quả điện di ở hình 4.10D, có xuất hiện vạch băng có kích thước khoảng 400bp với chủng B. cereus D1.7 và có phản ứng âm tính với đối chứng âm B. subtilis. Vì vậy có thể khẳng định rằng chủng B. cereus D1.7 có mang gen mã hóa độc tố bc-D-ENT.
Phát hiện gen cytK (hình 4.10E)
CytK là loại độc tố có khả năng gây tử vong cao hơn các loại độc tố khác của B. cereus. Theo Ngamwongsatit el al. (2008), gần 90% chủng B. cereus có thể mang gen này. Trong đề tài này tôi tiến hành PCR với cặp mồi CytK với kích thước sản phẩm dự kiến là 605bp.
Cặp Mồi CytK khuếch đại vạch băng có kích thước 605bp (Lund và Cs 2000) đã được Graham Burgess và Paul Horwood sử dụng trong công trình nghiên cứu phát hiện gen mã hóa độc tố của vi khuẩn B. cereus gây ngộ độc thực phẩm. Qua kết quả điện di ở hình 4.10E và dựa vào công trình nghiên cứu có thể thấy rằng có xuất hiện vạch băng có kích thước khoảng 600bp với chủng B. cereus D1.7 và có phản ứng âm tính với chủng vi khuẩn đối chứng, chứng tỏ rằng chủng B. cereus D1.7 có mang gen mã hóa độc tố CytK gây ngộ độc thực phẩm với thể bệnh tiêu chảy.
Phát hiện gen mã hóa độc tố entFM (hình 4.10F)
Độc tố FM (entFM) là độc tố có bản chất protein với vai trò và đặc tính chưa được biết đến. Bằng chứng cho sự tồn tại của một enterotoxin này của B. cereus lần đầu tiên được phát hiện bởi Granum et al. (1996). Các nghiên cứu tỷ lệ cho thấy entFM được phát hiện ở hầu hết các chủng liên quan đến sự bùng phát dịch bệnh. Graham Burgess và Paul Horwood đã sử dụng cặp mồi entFM khuếch đại đoạn gen mã hóa độc tố entFM có kích thước là 1269bp [12].
Trong đề tài này tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi entFM với kích thước sản phẩm dự kiến là 1269bp. Qua hình ảnh điện di 4.10F có thể thấy rằng có xuất hiện vạch băng có kích thước khoảng 1300bp với chủng B. cereus D1.7 và có phản ứng âm tính với chủng vi khuẩn đối chứng, chứng tỏ
rằng chủng B. cereus D1.7 cómang gen mã hóa độc tố EntFM gây ngộ độc thực phẩm với thể bệnh tiêu chảy.
Ngộ độc thực phẩm do B. cereus là một mối quan tâm lớn trên toàn thế giới [35]. Do đó, các phương pháp đơn giản, nhanh chóng để phát hiện các tế bào thuộc chủng B. cereus trong các mẫu thực phẩm là rất quan trọng. Vì vậy, tôi muốn xây dựng một phương pháp đáng tin cậy cho việc xác định nhanh sự có mặt của B. cereus có khả năng gây ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam.
Kỹ thuật PCR được cho là nhanh và đơn giản để nhận biết thực phẩm có khả năng gây ngộ độc thực phẩm do các độc tố từ B. cereus [35]. Hansen et al.
(2001) đã sử dụng cặp mồi đặc hiệu để phát hiện trình tự 16S rDNA đặc trưng cho nhóm B. cereus. Nooratiny, I. and Sahilah, A. M (2013) đã sử dụng kỹ thuật này để phát hiện gen entFM và hblA mã hóa độc tố của B. cereus BC1. Monika Ehling – Schulz et al. (2006) đã sử dụng kỹ thuật này để phát hiện các gen mã hóa độc tố HBL, NHE, cytK.
Trong nghiên cứu này tôi đã dùng kỹ thuật PCR để phát hiện thành công các gen hblA, hblD, nheA, cytK, entFM mã hóa độc tố hoặc một trong các thành phần độc tố gây ngộ độc thực phẩm của B. cereus trong thời gian (4-5 giờ) ngắn hơn so với phương pháp truyền thống (ít nhất 3 ngày). Đây là một bằng chứng cho thấy kỹ thuật này là nhanh chóng và đơn giản để nhận biết thực phẩm có khả năng gây ngộ độc do B. cereus ở Việt Nam.