Tỷ lệ sống sót của chế phẩm sau thời gian bảo quản

L ỜI MỞ ĐẦU

3.5.3. Tỷ lệ sống sót của chế phẩm sau thời gian bảo quản

Với điều kiện bảo quản nhiệt độ và độ ẩm của phòng thí nghiệm, chế

phẩm được kiểm tra khảnăng sống sót ở hai mốc thời gian là 3 tháng và 7 tháng, kết quảđược trình bày trong bảng sau:

Bảng 3. 12: Khả năng sống sót sau quá trình bảo quản của chế phẩm Bacillus

Thời gian bảo quản Mật độ vi sinh vật (CFU/g) P5QN4 P4QN11 Sau sấy 2,55.108 4,68.107 3 tháng 2,68.108 4,41.107 7 tháng 1,39.108 1,37.107 Mẫu 1: chế phẩm P4QN11 sấy ngày 13/4 mật độ sau sấy 4,68.107

(CFU/g), sau thời gian bảo quản 3 tháng, mật độ sau bảo quản là: 4,41.107

(CFU/g) . , sau 7 tháng mật độ sau bảo quản là: 1,37.107 (CFU/g) tỷ lệ sống sót

đạt 99,7% sau 3 tháng bảo quản và 93% sau 7 tháng bảo quản

Mẫu 2: chế phẩm P5QN4 sấy ngày 13/4 mật độ sau sấy 2,55.108(CFU/g), thời gian bảo quản 3 tháng mật độ sau bảo quản là: 2,68.108 (CFU/g), sau 7 tháng mật độ sau bảo quản là: 1,39.108 (CFU/g) tỷ lệ sống sót đạt 100% sau 3 tháng bảo quản và 97% sau 7 tháng bảo quản.

Kết luận chung sau 7 tháng bảo quản, mật độ bào tửthay đổi ở mức không

đáng kể, chế phẩm thu được hoàn toàn phù hợp với việc bảo quản ở điều kiện

thường.

Như vậy hai chế phẩm Bacillus tiềm năng thu được từ nghiên cứu có đầy

đủđặc tính probiotic như các chế phẩm đã có trên thịtrường hiện nay. Nhưng có tính ưu việt hơn khi các chế phẩm này được thu thập từ các nguồn mẫu tại Việt Nam, đã xác định tính nhạy cảm với các kháng sinh thông dụng, đặc biệt chế

69 từ lâu đời mà hầu hết các chủng vi khuẩn đều đã kháng được. Độ ẩm chế phẩm

đạt 10 – 11%, tương đương độ ẩm của các chế phẩm trên thị trường như chế

phẩm Bacillus Pro của công ty Biospring có thời gian bảo quản là 24 tháng. Riêng về mật độ chế phẩm đạt 107 – 108 CFU/g thấp hơn so với mật độ 109 – 1010 CFU/g của các chế phẩm trên thị trường do các chủng probiotic tiềm năng

trong nghiên cứu này chưa được khảo sát, lựa chọn điều kiện lên men thu mật độ

sinh khối cao, mà chỉ được hoạt hóa đạt mật độ 107 – 108 CFU/ml rồi tiến hành tạo bào tử thu chế phẩm dẫn tới mật độ của chế phẩm cũng chỉ đạt 107 – 108

70

PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO

Kết luận

1)Thu thập, sàng lọc và tuyển chọn được 52 chủng Bacillus tiềm năng từ

bộsưu tập 141 chủng ban đầu.

2)Tuyển chọn được 2 chủng Bacilluslà P5QN4 và P4QN11 có đầy đủ các

đặc tính probiotic, có khảnăng sản sinh cả ba enzyme ngoại bào hỗ trợ tiêu hóa, tỷ lệ sống sót >70% trong môi trường đường ruột giả lập, khảnăng bám dính 106

CFU/cm2 niêm mạc ruột gà.

3)Đề xuất quy trình tạo và tinh sạch bào tửBacillus với thời gian lên men chủng trong môi trường DSM thu bào tử là 48 giờ, thời gian xử lý nhiệt 80oC để

tinh sạch dịch bào tử là 20 phút. Thu nhận được hai chế phẩm probiotic dạng bào tửBacillus là: P5QN4 mật độđạt 108 CFU/g và P4QN11 mật độ đạt 107 CFU/g.

4)Chế phẩm thu được có khả năng sinh cả ba enzyme ngoại bào (protease, amylase, cellulose) hỗ trợ tiêu hóa, sống sót và sinh trưởng trong môi

trường đường ruột giả lập, bảo quản tốt ở điều kiện thường, tỷ lệ sống sót đạt >90% sau 7 tháng.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các kết quả thu được sẽ tiếp tục nghiên cứu để ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi:

- Nghiên cứu nâng cao mật độ chế phẩm probiotic thông qua nâng cao mật

độ tếbào sinh dưỡng tiếp giống.

71

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Murray, Patrick R., Ken S. Rosenthal, and Michael A. Pfaller. Medical microbiology E-book. Elsevier Health Sciences, 2020.

[2] Redmond, Caroline, et al. "Identification of proteins in the exosporium of Bacillus anthracis." Microbiology 150.2 (2004): 355-363.

[3] Stewart, George C. "The exosporium layer of bacterial spores: a connection to the environment and the infected host." Microbiology and Molecular Biology Reviews 79.4 (2015): 437-457.

[4] Munoz, Lawrence, Yoshito Sadaie, and Roy H. Doi. "Spore coat protein of

Bacillus subtilis. Structure and precursor synthesis." Journal of Biological Chemistry 253.19 (1978): 6694-6701.

[5] Henriques, Adriano O., and Charles P. Moran, Jr. "Structure, assembly, and function of the spore surface layers." Annu. Rev. Microbiol. 61 (2007): 555- 588.

[6] RYTER, A. (1965, January). “Morphologic study of the sporulation of

Bacillus subtilis”. In Annales de l'Institut Pasteur (Vol. 108, pp. 40-60).

[7] Online Biology Notes - A Complete notes for Students.

https://www.onlinebiologynotes.com

[8] Moir, Anne. "How do spores germinate?." Journal of applied

microbiology 101.3 (2006): 526-530.

[9] Cutting M. Simon (2016): The Use of Probiotic Bacteria as Animal Feed Supplements. Hội thảo Chế phẩm prbiotics chịu nhiệt của BioSpring. Hà Nội

tháng 3 năm 2016.

[10] Huynh A. Hong, Le Hong Duc, Simon M. Cutting (2005): The use of

bacterial spore formers as probiotic. ELSEVIER FEMS Microbiology

Reviews 29 (2005) 813-835.

[11] Han, D., et al. "Response surface optimization of the cultivation conditions

and medium composition a novel probiotic strain Bacillus pumilus

72 [12] Nguyễn Thị Trần Thụy (2009), "Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn

Bacillus phân lập từđất vườn sinh Protease kiềm".

[13] Phương ThịHương, Vũ Văn Hạnh. "Lựa chọn điều kiện lên men cho sự sinh

trưởng chủng Bacillus subtilis BSVN15 ứng dụng sản xuất chế phẩm

probiotic trong chăn nuôi”.

[14] Hương, Phạm Trần Thùy, and Đỗ Thị Bích Thủy. "Ảnh hưởng của một số

yếu tố lên quá trình thu nhận chế phẩm amylase ngoại bào từBacillus subtilis

DC5." Tạp chí khoa học, Đại học Huế 71.2 (2012): 187-199.

[15] Thành, Ngô Tự, et al. "Nghiên cứu hoạt tính enzym ngoại bào của một số

chủng Bacillus mới phân lập và khảnăng ứng dụng chúng trong xử lý nước thải." VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology 25.2 (2009).

[16] Hồ Trung Thông, Hồ Lê Huỳnh Châu (2009). Nghiên cứu khả năng sống

trong môi trường đường tiêu hóa của động vật của một số chủng Vi sinh vật nhằm từng bước chọn lọc tạo nguyên liệu sản xuất probiotics. Tạp chí khoa học, 09 (55), Trường Đại học Nông lâm, Đại học Huế, tr. 82.

[17] Khuất Hữu Thanh, Bùi Văn Đạt (2010). Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus để tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong nuôi trồng thủy sản. Tạp chí khoa học công nghệ, 05 (48), tr. 57-63

[18] Foysal, Md Javed, and Asura Khanam Lisa. "Isolation and characterization of Bacillus sp. strain BC01 from soil displaying potent antagonistic activity against plant and fish pathogenic fungi and bacteria." Journal of Genetic Engineering and Biotechnology 16.2 (2018): 387-392.

[19] Araya, M., et al. "Guidelines for the evaluation of probiotics in food. Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food." (2002).

[20] Jose Luis Balcazar, Ignacio de Blas, Imanol Ruiz-Zarzuela, David Cunningham, Daniel Vendrell và Jose Luis Muzquiz (2006), "The role of probiotics in aquaculture", Veterinary Microbiology, 114(3 - 4), 173–186.

73 [21] Nicolae corcionivoschi, Dan Drinceanu, Lavinia Stef, Ioan Luca, Călin

Julean và Mingyart, Dr. Oana (2010), "Probiotics - Identification and ways of action ", Innovative Romanian Food Biotechnology, 6 1-11.

[22] Xiaohua Guo và các cộng sự. (2006), "Screening of Bacillus strains as potential probiotics and subsequent confirmation of the in vivo effectiveness of Bacillus subtilis MA139 in pigs", Antonie Van Leeuwenhoek. 90(2), tr. 139-146.

[23] Jorge Olmos và J Paniagua-Michel (2014), "Bacillus subtilis A Potential Probiotic Bacterium to Formulate Functional Feeds for Aquaculture",

Microbial and Biochemical Technology, 6(7), 361 – 365

[24] Nguyễn Hoàng Anh Nguyễn Thị Lâm Đoàn* (2018), "Bacillus có tiềm năng

probiotic từ ruột gà".

[25] Weiwei Wang Youbiao Ma, Haijun Zhang, Jing Wang, Wenming Zhang, Jun Gao, Shugeng Wu (2018), "Supplemental Bacillus subtilis DSM 32315 manipulates intestinal structure and microbial composition in broiler chickens".

[26] Monteiro, Sandra M., et al. "A procedure for high‐yield spore production by

Bacillus subtilis." Biotechnology Progress 21.4 (2005): 1026-1031.

[27] Nicholson WL, Setlow P (1990) Sporulation, germination and outgrowth. In: Harwood CR, Cutting SM (eds) Molecular

[28] Carvalho, Ana S., et al. "Relevant factors for the preparation of freeze-dried lactic acid bacteria." International Dairy Journal 14.10 (2004): 835-847. [29] Le, Nguyen Thi My, and Nguyen Thuy Huong. "Microencapsulation of

Lactobacillus fermentum 39-183 by spray drying in the presence of prebiotics."

[30] Tổng cục thống kê Việt Nam, “Báo cáo tình hình ngành chăn nuôi năm

2019-2020”, www.gso.gov.vn

[31] Reduced Antibiotic Use in Livestock: How Denmark Tackled Resistance (2014).

74 [33] Le Hong Duc Tran Thu Hoa, Rachele Isticato, Loredana Baccigalupi, Ezio Ricca, Pham Hung Van, and Simon M. Cutting (2001), "Fate and Dissemination of Bacillus subtilis Spores in a Murine Model".

[34] Hồ Trung Thông Hồ Lê Quỳnh Châu, Nguyễn Thị Khánh Quỳnh (2010),

"Đánh giá khả năng bám dính và kháng khuẩn ở mức độin vitro của một số

chủng vi sinh vật có tiềm năng sử dụng làm probiotics”

[35] Nguyễn Thị Lộc Lê Văn An, Nguyễn Minh Hương, Nguyễn Thị Thu Trang (2017), "Nghiên cứu sử dụng chế phẩm probiotic (Bacillus subtilis và Lactobacillus plantarum) trong khẩu phần thức ăn nuôi lợn giai đoạn sau cai sữa và nuôi thịt".

[36] Nguyễn Đức Hiền Lê Thị Hải Yến (2016), “ Khảo sát đặc tính probiotic các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập tại các tỉnh đồng bằng sông cửu long”.

[37] Garrity, George M., Julia A. Bell, and Timothy G. Lilburn. "Taxonomic outline of the prokaryotes. Bergey’s manual of systematic bacteriology." New York (2004).

[38] Nguyễn Lân Dũng, Giáo trình vi sinh vật học, 1962: Đại học tổng hợp - Hà Nội

[39] Khuất Hữu Thanh và Bùi Văn Đạt (2010), "Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus để tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong nuôi trồng thủy sản", Tạp chí khoa học và công nghệ48(5), 57 - 63

[40] Latorre, Juan D., et al. "Evaluation and selection of Bacillus species based on enzyme production, antimicrobial activity, and biofilm synthesis as direct- fed microbial candidates for poultry." Frontiers in veterinary science 3 (2016): 95.

[41] Son Chu-Ky, Thi-Khanh Bui, Tien-Long Nguyen và Phu-Ha Ho (2014), "Acid adaptation to improve viability and X-prolyl dipeptidyl aminopeptidase activity of the probiotic bacterium Lactobacillus fermentum

HA6 exposed to simulated gastrointestinal tract conditions", International Journal of Food Science and Technology, 49 565–570.

75 [42] Nguyễn Hoàng Anh Nguyễn Thị Lâm Đoàn* (2018), "Bacillus có tiềm năng

probiotic từ ruột gà"

[43] Trần Quốc Việt, Bùi Thu Huyền, Dương Văn Hợp, Vũ Thành Lâm (2009).

Phân lập, tuyển chọn và đánh giá các đặc tính probiotic của một số chủng vi sinh vật hữu ích để sản xuất các chế phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi.

Tạp chí Khoa học công nghệ chăn nuôi, 16: 521-537.

[44] Alp, Duygu, and Hakan KuleaŞan. "Determination of competition and

adhesion abilities of lactic acid bacteria against gut pathogens in a whole- tissue model." Bioscience of Microbiota, Food and Health (2020).

[45] PGS.TS.Biền Văn Minh Trường ĐHSP – Đại học Huế

[46] Tavares, Milene B., et al. "Bacillus subtilis endospores at high purity and recovery yields: optimization of growth conditions and purification method." Current microbiology 66.3 (2013): 279-285.

[47] Chávarri, María, Izaskun Marañón, and María Carmen Villarán.

"Encapsulation technology to protect probiotic bacteria." Probiotics. IntechOpen, 2012.

[48] Nguyễn, Kim Nữ Thảo, et al. "Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen Vi sinh vật." (2020).

[49] Vũ Thanh Thảo, Nguyễn Minh Thái, Nguyễn Thị Linh Giang, Trần Hữu

Tâm và Đông, Trần Cát (2014), "Nghiên cứu đặc tính probiotic của Bacillus subtilis BS02", Tạp chí Y Học Thực Hành907(3), 21 - 25.

[50] Casula, Gabriella, and Simon M. Cutting. "Bacillus probiotics: spore germination in the gastrointestinal tract." Applied and environmental microbiology 68.5 (2002): 2344-2352.

[51] Alp, Duygu, Hakan Kuleaşan, and Aylin Korkut Altıntaş. "The importance

of the S-layer on the adhesion and aggregation ability of lactic acid bacteria." Molecular biology reports 47.5 (2020): 3449-3457.

[52] Barbosa, T.M., Serra, C.R., La Ragione, R.M., Woodward, M.J., Henriques, A.O., 2005. Screening for Bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract. Appl. Environ. Microbiol. 71

76 [53] Spinosa, M.R., Braccini, T., Ricca, E., De Felice, M., Morelli, L., Pozzi, G., Oggioni, M.R., 2000. On the fate of ingested Bacillus spores. Res. Microbiol. 151, 361e368.

[54] Nguyễn Thị Minh Đức (2021), “Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp. sử dụng làm probiotic cho vật nuôi và khảo sát khả năng không chuyển/nhận gen kháng kháng sinh”, Luận văn thạc sĩ