L ỜI MỞ ĐẦU
1.4.2 Ứng dụng Bacillus sp làm chế phẩm probiotic
1.4.2.1 Các dạng chế phẩm probiotic
- Probiotic cô lạnh: chế phẩm được hạ xuống nhiệt độ rất thấp khiến vi khuẩn trởlên khô như bột nhưng không bị hủy diệt, vi khuẩn sẽ sống trở lại khi
được uống vào
- Probiotic viên nang: các lợi khuẩn thường được phối kết hợp với nhau rồi nén vào viên nang đóng vỉđể tiện cho mỗi lần sử dụng
- Probiotic dạng bột: vi khuẩn lúc này tồn tại ở dạng bào tử, khi sử dụng
được hòa với nước đi vào cơ thể vật chủ và nảy mầm.
- Probiotic dạng lỏng: sử dụng trực tiếp, dạng này thường chứa hàm
lượng probiotic rất cao
1.4.2.2 Tiêu chí tuyển chọn các chủng vi khuẩn sử dụng thu chế phẩm probiotic sử dụng trong thức ăn chăn nuôi
- Chủng vi khuẩn phải được xác định mang tính chất probiotic, đáp ứng các yêu cầu đối với chủng probiotic (độ an toàn, khả năng đề kháng với môi
trường tiêu hóa vật nuôi, ...)
- Chủng vi khuẩn đã được nghiên cứu lâm sàng, khuyến nghị liều lượng sử dụng
21 - Chủng vi khuẩn có khảnăng đáp ứng quy trình công nghệ sản xuất thức
ăn chăn nuôi, đặc biệt là yếu tố nhiệt độ, bởi trong một số giai đoạn như ép đùn
tạo viên thức ăn nhiệt độ có thểđạt 110 – 150oC
- Chế phẩm đảm bảo khảnăng lưu trữ bảo quản ởđiều kiện thường
Đã có nhiều nghiên cứu chứng tỏ mức độ phù hợp của vi khuẩn Bacillus
trong ứng dụng sản xuất chế phẩm probiotic, đặc biệt là khả năng tạo bào tử để đáp ứng yếu tố nhiệt độ trong quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi.
Hình 1. 5: Khả năng chịu nhiệt của một số probiotic dạng bào tử Bacillus [32]
Theo số liệu được công bốvào năm 2016 của công ty Biospring, khi khảo sát khả năng chịu nhiệt của ba chế phẩm probiotic dạng bào tử Bacillus ở các nhiệt độ 80 = 100oC cho thấy mật độ chế phẩm không có sự thay đổi về pha log trong khoảng thời gian từ 10-30 phút tác động nhiệt, đặc biệt với thời gian 10 phút nhận thấy dường như không có sự thay đổi đáng kể về mật độ chế phẩm.
Điều này khẳng định bào tử Bacillus hoàn toàn có khảnăng đáp ứng được nhiệt
độ 950C của quy trình công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi.
Bacillus sp được nghiên cứu rộng rãi về các tính chất probiotic của mình, thử
nghiệm invitro trên vật nuôi. Bằng việc bổ sung chế phẩm Bacillus vào vật nuôi
dưới dạng bào tử, đã có các nghiên cứu chứng tỏ khả năng nảy mầm phát triển của bào tửBacillus subtilis trong ruột chuột. [33]
Nghiên cứu của Hồ Lê Quỳnh Châu và ctv đánh giá tiềm năng về khả năng bám dính, kháng E. coli và B. cereustrong điều kiện in vitro của các chủng vi sinh vật: B. pumilus N1, B. pumilus B2/1, B. clausii B1, B. clausii B2/2, B.
22
subtilis LII4. Kết quả cho thấy tất cả các chủng đều có khảnăng tự bám dính. Có 2 chủng (B. pumilus B2/1, B. clausii B2/2) có khảnăng bám dính đồng thời với vi khuẩn E. coli và B. cereus. B. pumilus B2/1 có khảnăng bám dính tốt đối với
B. cereus (49,87%). Chủng B. subtilis LII4 và B. pumilus B2/1 đối kháng với E. coli. [34]
Trong nghiên cứu của các nhà khoa học trường đại học nông lâm và đại học khoa học Huế được triển khai tại Trung tâm nghiên cứu Thủy An, thuộc Viện Nghiên cứu phát triển, trường Đại học Nông Lâm Huế. Nghiên cứu trên tổng số 24 lợn lai F1 (Large White x Móng Cái), 35 ngày tuổi, khối lượng trung bình 7,5 kg ±
0,12 được phân bố ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức tương ứng với 4 mức bổ sung chế phẩm khác nhau (108 CFU/g thức ăn, 2.108 CFU/g thức ăn và 3.108 CFU/g thức ăn), mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại với 3 ô chuồng (2 con lợn/1 ô chuồng). Lợn được nuôi ở ba giai đoạn, nhưng chỉ bổ sung chế phẩm ở giai đoạn 7-20 kg
và giai đoạn 20 - 50 kg, giai đoạn từ 50 - 80 kg không bổ sung. Kết quả cho thấy mức bổ sung 3 x 108 CFU/g thức ăn có ảnh hưởng tích cực đến lượng ăn vào, tăng trọng bình quân đạt 638,8 g/ngày và chi phí thức ăn giảm được 16% so với
lô đối chứng.[35]
Trong nghiên cứu của Xiaohua Guo và các cộng sự, B. subtilisMA139 đã được chọn là một loại vi khuẩn có tiềm năng probiotic và được cho lợn con ăn
với 3 nồng độ 2,2 × 105, 2,2 × 106 hoặc 2,2 × 107 CFU / g thức ăn trong một thử
nghiệm cho ăn 28 ngày. Bên cạnh chế độ ăn kiểm chứng không bổ sung lợi khuẩn này mà sử dụng thuốc kháng sinh bình thường. Chín mươi heo con trong
khoảng từ 35 đến 40 ngày tuổi đã được sử dụng trong các thử nghiệm invitro. Kết quả cho thấy B. subtilisMA139 tăng cường mức sinh trưởng hàng ngày (p = 0,10) và khả năng tiêu hóa thức ăn (p = 0,03) của lợn so với đối chứng. Năng
suất nuôi của lợn được cho ăn B. subtilis MA139 không khác biệt so với lợn
được cho ăn chế độ ăn kháng sinh. Số lượng vi khuẩn E.coli giảm (p = 0,05) trong các mẫu phân của lợn được cho ăn B. subtilis MA139 với 2,2 × 105 CFU / g thức ăn. [8]
Trong nghiên cứu của Lê Thị Hải Yến và ctv (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Vemedim 2 - Chi cục Thú y Cần Thơ) các chủng B.subtilis AG27,
AG60, VL05 và VL28 đều có các đặc tính để làm nguồn nguyên liệu sản xuất
probiotic như: khả năng nhạy cảm đối với kháng sinh, khả năng sinh enzyme
23 1.4.2.3 Chế phẩm probiotics trên thị trường có nguồn gốc từ vi khuẩn
Bacillus sp
Chế phẩm dành cho người:
B. clausii dạng lỏng trong sản phẩm Enterogermina bổ sung cho trẻsơ
sinh phòng và trị bệnh tiêu chảy với tỉ lệ bào tử là 2.109 bào tử/5ml dịch.
B. subtilis và B. licheniformis sử dụng trong lên men đậu nành sản phẩm Natto của Nhật Bản
Hình 1. 6: Sản phẩm men tiêu hóa Enterogermina và vi khuẩn Natto dạng bột
Chế phẩm dành cho vật nuôi:
Chế phẩm Bacillus Subtilis, hàm lượng sản phẩm đạt 109-1010 cfu/g của công ty Bio One
Chế phẩm Bacillus sp, hàm lượng sản phẩm đạt 109-1011 cfu/g của công ty Bio spring
Chế phẩm probiotic ProTM swine, hàm lượng sản phẩm đạt 108 cfu/g
Như vậy chủng vi khuẩn Bacillus qua nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ tính
an toàn, có các đặc tính probiotic, khả năng tạo bào tử giúp chủng chịu được nhiệt độ cao của quy trình công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi, hoàn toàn đáp
24
ứng các điều kiện của probiotic. Mặc dù trên thị trường Việt Nam hiện nay đã
xuất hiện các chế phẩm Bacillus sử dụng trong chăn nuôi nhưng đều có nguồn gốc nhập khẩu hoặc ứng dụng quy trình công nghệ của nước ngoài, chủng giống từnước ngoài, cũng như chưa được đặc biệt quan tâm đánh giá về tính nhạy cảm với các kháng sinh thông dụng. Chính vì thế ở nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu các chủng vi khuẩn Bacillus được phân lập từ các mẫu phân vật nuôi tại Việt Nam, nghiên cứu hoàn thiện quy trình từ việc sàng lọc, đánh giá chủng tiềm năng
probiotic đến thu chế phẩm Bacillus probiotic dạng bào tử, các chủng tiềm năng đều được đánh giá khảnăng nhạy cảm kháng sinh trong quá trình sàng lọc.
25
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Chủng vi sinh vật
Chủng vi sinh vật tiềm năng sử dụng trong nghiên cứu được lấy từ 3 nguồn khác nhau, bao gồm:
+ 141 chủng vi sinh vật phân lập từ 0 mẫu phân gà và lợn được lấy tại Hà Nội và Quảng Ninh được nhận từ Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Thông tin của địa điểm lấy mẫu được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2. 1 Thông tin địa điểm lấy mẫu phân lập vi sinh vật
STT Ký hiệu
chủng Địa điểm lấy mẫu Tọa độ lấy mẫu
1 CTY Gà Tiên Yên – Tiên Yên, Quảng Ninh 21
o32.437 N; 107o42.401 S
2 CHL Gà Hồ Lai – Tiên Yên, Quảng Ninh 21
o32.437 N; 107o42.401 S
3 CQN Chăn nuôi nông hộ – Gà Bắc Giang thả
vườn – Tiên Yên, Quảng Ninh 21
o19.30 B – 107o24.25 Đ
4 P1QN Chăn nuôi nông hộ – giống lợn lai – 10kg/con - Tiên Yên, Quảng Ninh 21
o19.30 B – 107o24.25 Đ
5 P2QN Chăn nuôi nông hộ – giống lợn lai – 50kg/con – Tiên Yên, Quảng Ninh 21
o19.30 B – 107o24.25 Đ
6 P2QN Chăn nuôi nông hộ – giống lợn lai – 90kg/con – Tiên Yên, Quảng Ninh 21
o19.30 B – 107o24.25 Đ
7 P3QN Trang trại lợn Tiên Yên (Chăn nuôi nông
hộ) – 1,5 tháng 20kg – Quảng Ninh 21
o19.41 B – 107o24.16 Đ
8 P4QN Trang trại lợn Tiên Yên (Chăn nuôi nông
hộ) – 3 tháng 60kg – Quảng Ninh 21
o19.41 B – 107o24.16 Đ
9 P5QN,
P6QN
Trang trại lợn Tiên Yên (Chăn nuôi nông hộ) – 1 năm 130kg – Quảng Ninh 21
o19.41 B – 107o24.16 Đ
10 PHN Chăn nuôi lợn nông hộ – Cầu Rau, thôn 7
Xã Phú Cát, Huyện Quốc Oai, Hà Nội 20
26 + Chủng probiotic so sánh BacillusBAD7 được lấy từ Bộsưu tập của Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội
+ Chủng probiotic Bacillus subtilis thương mại nhận được từ công ty Cổ
phần Công nghệ Sinh học mùa xuân – Biospring
Hình 2. 1: Chủng vi khuẩn BAD7 và B.Subtilis thu thập
2.1.2. Hóa chất – môi trường
Môi trường Nutrient Broth, pH 7 – Himedia
Môi trường Nutrient Agar thương mại Himedia
Môi trường Difco sporulation media (DSM):NB 8g.L-1,KCl 1g.L-1, MgSO-
4 0,25g.L-1. 1L môi trường bổ sung thêm 1mL mỗi dung dịch Ca(NO3)2 1M, MnCl2 10 mM, FeSO4 1 mM) sau khi tiệt trùng.
Cơ chất bổ sung: casein, tinh bột tan, carboxymethyl cellulose (CMC). Hóa chất nhuộm Gram: Tím tinh thể (Crystal Violet), Dung dịch Iod và thuốc nhuộm bổ sung Safranin, cồn 96o.
Hóa chất nhuộm Melachite: Melachite green, Safranin.
Dịch dạ dày giả lập: 0,3g pepsine hoạt lực 0,7 FIP – U/mg (MERCK), NaCl
0,5% hòa tan trong 100ml nước cất, điều chỉnh pH 2,5.
Dịch ruột non giả lập: 0,1 g pancreatine hoạt lực 350 FIP – U/g protease, 6000 FIP – U/g lipase; 7500 FIP – U/g amylase (MERCK); 0,3g muối mật; NaCl
0,5%; được hòa tan trong 100 ml, điều chỉnh pH 8.
Hóa chất phòng thí nghiệm: NaCl, HCl, FeSO4, dd đệm PBS 1X, dung dịch Triton X, dung dịch Acid Etylen Diamin Tetra Acetic (EDTA), Maltodextrin, Tris-HCl, glycerol,…
27
2.1.3. Các thiết bị trong phòng thí nghiệm
Bảng 2. 2: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Tên thiết bị Nơi sản xuất
Cân điện tử, AB 201, Mettler Toledo Thụy Sỹ Máy đo pH, 320pH Metter, Mettler Toledo Thụy Sỹ
Tủ cấy vô trùng Pháp
Nồi hấp khử trùng, ALP MC-40DP Nhật Bản
Máy ly tâm, Biofuge fresco, Kendro Đức
Máy lắc ổn nhiệt, BSI-25R CPT Hàn Quốc
Pipetman, Gilson Pháp
Máy đo OD, Sp-3000 nano, Optima Nhật Bản
Bể ổn nhiệt Memmert WNB22 Đức
Tủ nuôi ổn nhiệt Đức
Thiết bị sấy phun Buchi B290 Thụy Sĩ
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính catalase
Catalase là một đặc điểm của đa số các vi sinh vật hiếu khí, hoạt tính này
được phát hiện bằng cách nhỏ H2O2 lên bề mặt khuẩn lạc, những chủng vi sinh vật hiếu khí xuất hiện bọt khí O2 chứng tỏ có hoạt tính catalase. [37]
2.2.2. Phương pháp nhuộm Gram
Nguyên tắc: dựa vào khảnăng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iốt, hình thành hai loại phức chất khác nhau.
Loại 1: vẫn giữ nguyên màu sắc của thuốc nhuộm, không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. vi sinh vật dạng này thuộc GP + P (bắt màu tím).
Loại 2: không giữ được màu thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. vi sinh vật dạng này thuộc GP - P (bắt màu hồng) [17].
Quy trình nhuộm gram sẽ gồm các bước sau: - Nhỏ sinh khối vi khuẩn lên lam kính sạch;
- Cố định mẫu bệnh phẩm bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn và để
28 - Các bước nhuộm:
Đầu tiên phủ dung dịch tím Gentian và để khoảng 30 giây sau đó rửa bằng nước. Bước này sẽ giúp nhuộm tất cả vi khuẩn thành màu tím đen
Tiếp theo phủ dung dịch Lugol để cốđịnh màu, cũng để khoảng 30 giây rồi rửa dưới nước. Dung dịch sẽ giúp gắn màu tím vào vi khuẩn đậm hay nhạt tùy thuộc vào loại của nó
Tẩy màu bằng cồn 96o để khoảng 30 giây và rửa nước. Đây là bước rất quan trọng để phân biệt loại vi khuẩn đã được dung dịch Lugol gắn chắc màu tím vào và loại màu tím bị tẩy trôi
Cuối cùng phủ dung dịch Fuchsin (Safanin) của Gram để khoảng 30 giây rồi rửa dưới nước sẽ làm các vi khuẩn đã được tẩy hết màu tím bắt lại màu
đỏ, những vi khuẩn đã bị nhuộm tím đen sẽ không bịảnh hưởng.
- Để khô tự nhiên
- Soi dưới vật kính dầu
2.2.3. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
Để lưu trữ được chủng vi khuẩn phục vụ cho các thí nghiệm trên cần có
phương pháp bảo quản giống tốt để tránh thoái hóa giống, các yếu tố ngoại cảnh
tác động tới độ chính xác của kết quả nghiên cứu.
Nguyên tắc: Ở nhiệt độ thấp sẽ hạn chế được sự sinh trưởng, phát triển
cũng như sự thoái hóa giống của vi khuẩn.
2.2.3.1.Phương pháp bảo quản trên môi trường thạch nghiêng
Môi trường NA được chuẩn bị trong các ống nghiệm thuỷ tinh, thanh trùng ở chế độ 121oC trong 15 phút, tiếp đó để nguội để tạo thạch nghiêng đến nhiệt độ phòng.
Các chủng vi khuẩn nghiên cứu được cấy chuyển sang đĩa thạch và được nuôi ở 37oC trong 24 giờ. Chủng vi khuẩn sau đó được cấy lại trên môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm và tiếp tục nuôi ở 37oC trong 24 giờ. Các ống nghiệm chứa giống vi sinh vật được lưu trữ trong tủ lạnh 2-4oC nhằm hạn chế sự sinh trưởng, phát triển và tránh sự thoái hóa giống. Giống được cấy truyền hàng
tháng và được hoạt hoá lại trước khi nhân giống cho lên men. Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng [18].
29
Phương pháp này phù hợp cho các chủng vi khuẩn sử dụng thường xuyên, thời gian bảo quản từ 1 – 3 tháng.
2.2.3.2. Phương pháp bảo quản trên môi trường dung dịch glycerol 10%
Phương pháp này có thể bảo quản giống trong thời gian dài, không thích hợp với các chủng vi khuẩn thường xuyên sử dụng.
Các chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu được cấy chuyển sang đĩa
thạch NA và nuôi ở 37oC trong 24 giờ. Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ đĩa thạch và hoạt hoá trong môi trường NB, ở 37oC, lắc 150v/p trong 24 giờ. Hút 500 mL
canh trường vi khuẩn vào ống eppendorf chứa sẵn 500 mL glycerol 50% (đã vô trùng). Sau đó, bảo quản giống ở - 20oC, phương pháp này giúp bảo quản giống trong vòng 1 - 2 năm [38].
2.2.4. Phương pháp quan sát hình thái và xác định mật độ tế bào
2.2.4.1. Phương pháp quan sát hình thái
Các chủng vi sinh vật probiotic và vi khuẩn kiểm định được làm tiêu bản và nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộm Gram để quan sát và nhận dạng vi sinh vật. Sau đó các chủng được chang cấy trên môi trường đĩa thạch NA để
quan sát, mô tảsơ lược về hình thái, màu sắc khuẩn lạc vi khuẩn. 2.2.4.2. Phương pháp xác định mật độ tế bào
Các phương pháp đểđịnh lượng mật độ tế bào sử dụng trong nghiên cứu: - Phương pháp đếm trực tiếp
Mật độ tế bào có thểđược xác định trực tiếp thông qua việc đếm số tế bào của mẫu pha loãng trên thiết bị buồng đếm của kính hiển vi, rồi ngoại suy ra mật
độ tế bào của dịch mẫu. Phương pháp này nhanh gọn nhưng có nhược điểm
không xác định được lượng tế bào sống. Trong nghiên cứu này, phương pháp