L ỜI MỞ ĐẦU
2.2.4. Phương pháp quan sát hình thái và xác định mật độ tế bào
2.2.4.1. Phương pháp quan sát hình thái
Các chủng vi sinh vật probiotic và vi khuẩn kiểm định được làm tiêu bản và nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộm Gram để quan sát và nhận dạng vi sinh vật. Sau đó các chủng được chang cấy trên môi trường đĩa thạch NA để
quan sát, mô tảsơ lược về hình thái, màu sắc khuẩn lạc vi khuẩn. 2.2.4.2. Phương pháp xác định mật độ tế bào
Các phương pháp đểđịnh lượng mật độ tế bào sử dụng trong nghiên cứu: - Phương pháp đếm trực tiếp
Mật độ tế bào có thểđược xác định trực tiếp thông qua việc đếm số tế bào của mẫu pha loãng trên thiết bị buồng đếm của kính hiển vi, rồi ngoại suy ra mật
độ tế bào của dịch mẫu. Phương pháp này nhanh gọn nhưng có nhược điểm
không xác định được lượng tế bào sống. Trong nghiên cứu này, phương pháp được sử dụng để đếm lượng bào tử có trong dịch bào tử pha loãng đã được nhuộm Melachite.
- Phương pháp đếm khuẩn lạc
Nguyên tắc: Trong môi trường thạch, các tế bào vi khuẩn sẽ phát triển tập trung tại một hay nhiều điểm và tạo thành khuẩn lạc. Khi khuẩn lạc đã hình thành
thì mắt thường có thể quan sát. Dựa vào số lượng khuẩn lạc thu được để ngoại suy ra mật độ tế bào của mẫu vi khuẩn.
30 Chuẩn bịcác đĩa petri và môi trường thạch vô trùng (vẫn ở dạng lỏng).
Đổ thạch vào các đĩa petri. Mỗi đĩa khoảng 15-20ml môi trường (Các thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng và quanh ngọn lửa đèn cồn). Để thạch đông
lại trong điều kiện vô trùng.
Hút 100µl dịch vi khuẩn đã pha loãng vào đĩa petri và nuôi cấy ở 370C trong 18-24 giờ, sau nuôi cấy, quan sát đĩa thạch xác định số lượng khuẩn lạc phát triển
Chọn những đĩa có từ 15 - 300 khuẩn lạc của 2 hệ số pha loãng liên tiếp để
tính mật độ tế bào. Mật độ tế bào vi sinh vật trung bình có trong 1ml hay 1g mẫu
được tính theo công thức:
) / ( . ). 1 , 0 (n1 n2 f1V CFU ml C N + = ∑ Trong đó:
- ∑C: tổng số khuẩn lạc đếm được ở tất cảcác đĩa.
- n1 : sốđĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1.
- n2 : sốđĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2.
- f1 : hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ nhất.
- V : thể tích mẫu cấy vào mỗi hộp peptri.
- Phương pháp đo độđục
Mật độ tế bào trong dịch mẫu tỉ lệ với khảnăng cản quang khi đi qua máy đo OD, thông qua các thí nghiệm đo quang ở các giá trị mật độ tế bào khác nhau
để lập đường chuẩn, từ đó ngoại suy mật độ tế bào dịch mẫu thông qua đường chuẩn đã xây dựng. Phương pháp này thích hợp cho xác định mật độ của các chủng vi khuẩn, tương đối nhanh và dễ thực hiện đặc biệt với các thí nghiệp lặp lại nhiều lần, các thời điểm lấy mẫu liên tiếp nhau, tuy nhiên không thểxác định
lượng tế bào sống và dễ có sai số.
2.2.5. Phương pháp xác định khảnăng sống sót trong môi trường pH thấp