L ỜI MỞ ĐẦU
2.2.7. Phương pháp xác định khả năng sống sót trong môi trường đường ruột.
đường ruột
Khả năng sống sót của các chủng vi sinh vật probiotic trong điều kiện
đường ruột được xác định theo phương pháp cho vi sinh vật probiotic tiếp xúc với môi trường dịch dạ dày và ruột non giả lập và định lượng khảnăng sống sót
phương theo phương pháp pha loãng liên tiếp và trang đếm trên đĩa thạch[41].
Phương pháp thực hiện cụ thểnhư sau:
* Chuẩn bị môi trường
- Môi trường dạ dày giả lập: 100ml NaCl 0,5% tiệt trùng ở 1210C trong 15
phút, sau đó bổ sung enzyme 0,3g pepsine hoạt lực 0,7 FIP – U/mg, điều chỉnh dịch đến pH 2,5, rồi lọc qua filter 0,2 µm.
- Môi trường ruột non giả lập: 100ml NaCl 0,5% tiệt trùng ở ở 1210C
trong 15 phút, sau đó bổ sung enzyme 0,1 g pancreatine hoạt lực 350 FIP – U/g protease, 6000 FIP – U/g lipase; 7500 FIP – U/g amylase (MERCK); 0,3g muối mật; NaCl 0,5%; điều chỉnh dịch đến pH 8, rồi lọc qua filter 0,2 µm.
* Các bước tiến hành xác định khả năng sống sót của các chủng vi sinh
vật được tháo tác như sau:
- Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa thạch giống, hoạt hoá trong 5ml môi trường NB, nuôi qua đêm ở 370C (hoạt hóa trong 3 ống falcol 15ml).
- Dịch sau khi nuôi, gộp chung thành một ống cho đủ 11ml rồi lấy 1ml để xác định mật độ khuẩn lạc sau hoạt hoá và 1ml đo OD (tại bước sóng 600nm), phần còn lại (9ml) đem đi ly tâm 6000g trong 7 phút ở 40C để thu sinh khối.
- Rửa sinh khối 2 lần bằng NaCl 0,5% đã vô trùng (Sau mỗi lần rửa, ly tâm thu sinh khối với chếđộ ly tâm như trên)
- Sinh khối sau khi rửa và loại bỏ phần dịch nổi được bổ sung dịch dạ dày giả lập (bổsung đến khi tổng lượng dịch và sinh khối là 9ml), đem votex hòa tan sinh khối và nuôi ở 370C,150 v/p.
33 - Lấy mẫu tại các thời điểm 0, 90 và 180 phút và xác định lượng tế bào vi khuẩn sống sót bằng phương pháp pha loãng liên tiếp và khuếch tán đĩa thạch NA, đếm số khuẩn lạc trên mỗi đĩa để ngoại suy mật độ vi khuẩn sống sót.
- Sau 180 phút tiếp xúc với dịch dạ dày giả lập, ly tâm (6000g trong 7 phút
ở 40C) để loại bỏ dịch nổi và thu sinh khối. Sinh khối sau khi ly tâm, loại bỏ phần dịch nổi được rửa 1 lần bằng NaCl 0,5% (đã vô trùng), sau đó tiếp tục được ly
tâm để thu sinh khối. Sinh khối sau khi rửa được bổ sung 6ml dịch ruột non giả
lập, votex hòa đều và được nuôi ở 370C, 150v/p.
- Tại các thời điểm 0, 90, 180 phút lấy mẫu và xá bằng phương pháp pha
loãng liên tiếp và khuếch tán đĩa thạch NA, đếm số khuẩn lạc trên mỗi đĩa để
ngoại suy mật độ vi khuẩn sống sót.
- Sử dụng công thức tính toán, xác định tỷ lệ sống sót của các chủng. - Các thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần.