L ỜI MỞ ĐẦU
2.2.8. Phương pháp xác định khả năng bám dính niêm mạc ruột của chủng
chủng Bacillus
Ở nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thử khảnăng bám dính của chủng vi khuẩn Bacillus tiềm năng bằng phương pháp phủ dịch tế bào vi khuẩn lên bề
mặt niêm mạc ruột gà tươi đã được xử lý theo phương pháp của Nguyễn Thị Lâm
Đoàn và cs [42, 43] có cải tiến trong quy trình xử lý ruột gà theo phương pháp
của Duygu ALP và cs[44]. Cụ thểcác bước thực hiện như sau:
- Thu thập và bảo quản mẫu ruột gà tươi:
Ruột gà tươi của động vật khỏe mạnh được thu thập từ một lò giết mổ thương mại và được chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng một giờ. Tính toàn vẹn của ruột được bảo đảm trong quá trình vận chuyển đến phòng thí nghiệm để
bảo vệ chúng khỏi bị ô nhiễm từ bên ngoài và sự phân hủy protein mô ruột. Tại phòng thí nghiệm ruột gà nhanh chóng được bảo quản lạnh đông (< 0oC) trong quá trình chờ thí nghiệm tiếp theo.
- Các chủng vi khuẩn Bacillus tiềm năng được hoạt hóa trong môi trường NB, nhiệt độ 37oC tốc độ lắc 150 v/p trong thời gian 14-18h. Sau đó thu dịch vi khuẩn, ly tâm rửa 2 lần bằng dung dịch đệm PBS 10mM pH 7,4, tiến hành xác
định mật độ dịch vi khuẩn bằng phương pháp pha loãng liên tiếp, khuếch tán trên
34 - Chuẩn bị mẫu ruột gà tươi:
Ruột gà tươi được xử lý cơ học, rửa bằng nước lạnh để loại phân và tạp chất lớn. Sau đó sử dụng dụng cụ chuyên dụng cắt lòng gà thành các khoanh tròn
có đường kính 1,5cm (bằng với đường kính đáy giếng đĩa vi chuẩn polystiren 12 giếng). Các khoanh lòng gà được rửa sạch bằng dung dịch đệm pH 7,4 (0,096 M NaCl, 0,008 M KH2PO4, 0,0056 M Na2HPO4, 0,0015 M KCl và 0,01 M EDTA) trong 20 phút ở nhiệt độ phòng.
Sau rửa, khoanh lòng gà được ngâm lạnh trong dung dịch đệm pH 6,5 – 7 (0.096 M NaCl, 0.008 M KH2PO4, 0.0056 M Na2HPO4, 0.0015 M KCl và 0.3 M
sucrose) để tránh bị khô trong quá trình chờ thí nghiệm.
- Sử dụng panh gắp y tế đặt các khoanh ruột gà vào các giếng của đĩa vi
chuẩn polystiren 12 giếng, chú ý để khoanh ruột gà sát với đáy giếng.
- Dùng micropipet bơm từ từ 1ml dịch vi khuẩn Bacillus đã xác định mật
độ ban đầu vào giếng để cho vi khuẩn tiếp xúc với niêm mạc ruột gà. Đem ủ ở
37oC, tốc độ lắc 40 v/p trong 1h. Với mẫu kiểm chứng thì thay dịch vi khuẩn bằng 1ml dung dịch đệm PBS 10mM pH 7,4
- Sau thời gian ủ, dùng panh y tế gắp khoanh ruột gà sang đĩa vi chuẩn 12 giếng thứ hai, thu dịch thừa sau khi gắp lòng gà đi ở giếng ban đầu rồi rửa giếng bằng dung dịch đệm PBS 10mM pH 7,4, 0,1% Triton X. Thu toàn bộ dịch thừa và dịch rửa giếng ban đầu, trộn đều rồi tiến hành xác định mật độ tế bào của mẫu dịch này để từđó xác định được mật độ vi khuẩn phủ trên bề mặt khoanh ruột gà.
- Khoanh ruột gà ở đĩa thứ hai được rửa 2 lần bằng dung dịch đệm PBS 10mM pH 7,4 để thử khả năng bám dính của chủng vi khuẩn. Sau đó tiến hành phá mẫu ruột gà, hòa tan trong 5ml dung dịch đệm PBS 10mM pH 7,4, 0,1% Triton X. Tiến hành xác định mật độ vi khuẩn của mẫu dịch này bằng phương
pháp pha loãng liên tiếp và khuếch tán đĩa thạch để xác định lượng vi khuẩn còn
35
Hình 2. 2: Phương pháp thí nghiệm xác định khả năng bám dính niêm mạc ruột gà của các chủng vi khuẩn Bacillus
Hiệu suất bám dính (%) của chủng vi khuẩn thử nghiệm được tính theo công thức:
𝐻𝐻 = log (log(𝐶𝐶𝐷𝐷) (%)) Với:
D: mật độ CFU/ml của chủng vi khuẩn còn bám dính trên mẫu ruột gà sau
ủ và rửa 2 lần.
C : mật độ CFU/ml vi khuẩn phủ lên bề mặt khoanh ruột gà trước khi rửa, (C = mật độ dịch vi khuẩn ban đầu – mật độ vi khuẩn còn trong giếng ủ ban đầu)
Khả năng bám dính ( CFU/cm2) của chủng vi khuẩn thử nghiệm được tính theo công thức:
𝐷𝐷
𝑆𝑆 ( 𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶/𝑐𝑐𝑐𝑐2)
Với:
D: mật độ CFU/ml của chủng vi khuẩn còn bám dính trên mẫu ruột gà sau
ủ và rửa 2 lần
S: diện tích khoanh ruột gà, khoanh ruột gà được đục bằng dụng cụ
36