Sau khi kiểm tra MLPA, 12 mẫu không phát hiện được bất thường cấu trúc gen tiếp tục được sàng lọc đột biến bằng phương pháp giải trình tự gen trực tiếp. ADN tổng số được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại các vùng trình tự mã hoá và vùng biên intron - exon (50-100 bp). Đối với PCR, mồi là các yếu tố quan trọng để giúp khuếch đại đặc hiệu các đoạn ADN quan tâm. Cặp mồi nhân vùng điều hoà và vùng mã hoá của gen được thiết kế dựa trên trình tự tham khảo của PAX6 mang mã số truy cập NG_008679.1 trên ngân hàng Genbank.
Ngoài yếu tố mồi kể trên, chu trình nhiệt phù hợp sẽ quyết định hiệu quả của phản ứng. Nhiệt độ sẽ đảm bào việc giãn xoắn và phân tách sợi ADN hoàn toàn, đồng thời cũng giúp tối ưu việc gắn và kéo dài chuỗi trong phản ứng trùng hợp chuỗi. Chúng tôi tiến hành khuếch đại vùng điều hoà và toàn bộ 13 exon của gen PAX6 bằng 9 phản ứng với các cặp mồi đặc hiệu trong đó exon 1 và 2; exon 9, 10 và 11; exon 12 và 13 được khuếch đại chung. Sản phẩm sau khi khuếch đại bởi phản ứng PCR được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0.8% và kết quả được trình bày trên hình 3.4. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm của các phản ứng PCR là một băng duy nhất sáng rõ, nghĩa bộ mồi khuếch đại thành công và đặc hiệu. Đoạn ADN được nhân lên từ phản ứng bằng cặp mồi tương thích có kích thước từ 300 bp tới 900 bp. Các sản phẩm này được tinh sạch và sử dụng cho phản ứng giải trình tự gen trực tiếp.
44
Hình 3.4: Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm PCR từ mẫu dị tật mống mắt. M: thang ADN chuẩn (marker 1kb plus), 1-13: sản phẩm PCR của
các exon 1 đến 13.