Bộ kít SALSA MLPA Probemix P219-B4 PAX6 bao gồm 44 đầu dò MLPA và khuếch đại các sản phẩm có kích thước từ 130 tới 463 nucleotide. Trong đó có 32 đầu dò cho vùng 11p13-14 bao gồm: 7 đầu dò xuôi dòng gen
PAX6, 13 đầu dò trên PAX6 (ít nhất mỗi đầu dò cho một exon trừ exon 11), 6 đầu dò nằm giữa gen PAX6 và WT1, 3 đầu dò nằm trên WT1, 3 đầu dò ngược dòng WT1. Ngoài ra, trong bộ kít còn có thêm 3 đầu dò nhắm đến vùng exon 1 của gen SOX2 và 9 đầu dò tham khảo nằm trên nhiễm sắc thể thường.
* Thực hiện phản ứng MLPA
Mẫu ADN được yêu cầu cho phản ứng MLPA là 5μl với nồng độ 10ng/μl trong đệm TE. Các bước tiến hành thí nghiệm như sau:
30
Lấy 5μl ADN tổng số (50ng) cho vào ống PCR 0.2ml. Biến tính ADN sử dụng máy gia nhiệt PCR trong 5 phút ở 98oC, sau đó làm lạnh mẫu xuống 25oC và lấy mẫu ra khỏi máy.
• Bước 2: Phản ứng lai
- Trộn đều dung dịch đệm MLPA buffer và MLPA probemic trước khi sử dụng bằng máy vortex sau đó quay ly tâm nhẹ các ống mẫu.
- Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng lai (hybridization mastermix): Hỗn hợp phản ứng lai bao gồm MLPA buffer và MLPA probemic pha theo tỷ lệ 1:1 ([1.5 μl MLPA buffer + 1.5 μl probemix]/trên 1 phản ứng). Trộn đều hỗn hợp bằng pipetting hoặc vortex.
- Bổ sung 3 μl hỗn hợp phản ứng lai vào mỗi mẫu ADN đã được biến tính trước đó, trộn đều pipetting.
- Tiến hành lai: ủ hỗn hợp phản ứng 95oC trong 1 phút, sau đó giữ mẫu ở 60oC trong 16-20 giờ.
• Bước 3: Phản ứng gắn kết
- Vortex đều 2 lọ dung dịch ligase buffer
- Chuẩn bị hỗn hợp Ligase 65: Công thức: [25 μl DDW + 3 μl Ligase Buffer A + 3 μl Ligase Buffer B]/1 phản ứng. Sau đó thêm 1 μl enzyme Ligase 65 và trộn đều hỗn hợp bằng pipetting (không vortex).
- Tiến hành hạ nhiệt độ ủ mẫu từ 60oC xuống 54oC và duy trì ở nhiệt độ này.
- Khi mẫu đang ở 54oC trong máy PCR, thêm 32 μl hỗn hợp ligase 65 vào mỗi ống mẫu, trộn đều bằng pipetting.
- Thực hiện gắn kết: Tiếp tục ủ mẫu 15 phút ở 54oC (gắn kết hai phần của đầu dò), sau đó nâng lên 98oC trong 5 phút để bất hoạt enzyme ligase 65. Hạ nhiệt độ xuống 20oC và có thể lấy mẫu ra khỏi máy PCR.
• Bước 4: Phản ứng PCR
- Trộn đều lọ Salsa PCR primer mix bằng vortex. Làm ấm Polymerase trong tay 10 giây để giảm độ nhớt.
31
- Công thức: [7.5 μl DDW + 2 μl Salsa PCR primer + 0.5 μl Salsa polymerase]/ 1 phản ứng. Trộn đều hỗn hợp này bằng pipetting và giữ trên khay đá lạnh.
- Khi các ống mẫu ở nhiệt độ phòng, thêm 10 μl hỗn hợp chứa polymerase vào mỗi ống mẫu. Trộn đều bằng pipetting.
- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR: Tiến hành 35 chu kỳ khuếch đại (95oC: 30 giây, 60oC: 30 giây, 72oC: 60 giây); 72oC: 10 phút; 15oC: dừng. Sản phẩm PCR có thể được lưu trữ ở 4oC trong vòng 1 tuần, hoặc lưu trữ lâu dài ở - 25oC với điều kiện tránh ánh sáng.
• Bước 5: Phân tích đoạn bằng điện di mao
- Sử dụng 0.7 μl sản phẩm PCR cho điện di mao quản nhằm phân tích các đoạn ADN đã được khuếch đại sau phản ứng.
- Chuẩn bị hỗn hợp:
- Công thức: [0.7 μl sản phẩm PCR + 0.2 μl sản phẩm PCR LIZ (GS500) + 9 μl HiDi formamide]. Đĩa chứa hỗn hợp sau pha trộn được làm ấm lên tới 86oC và duy trì trong 3 phút, sau đó làm lạnh xuống 40oC trong 2 phút. Lúc này, hỗn hợp đã sẵn sàng cho điện di mao quản.
- Cài đặt các thông số cho điện di mao quản như sau:
Bảng 2.1: Thông số cài đặt máy điện di mao quản để chạy phân tích MLPA
Thiết bị Mao quản Thông số chạy điện di ABI-3500 Tám mao quản 50
cm
Chương trình chạy: Phân tích đoạn Hiệu điện thế tra mẫu: 1.6kV Thời gian tra mẫu: 15 giây Hiệu điện thế chạy: 15kV Thời gian chạy: 1800 giây Nhiệt độ chạy: 60oC Hoá chất: POP 7
32
Sử dụng phần mềm Coffalyzer để phân tích kết quả sau khi chạy điện di trên máy ABI 3500. Tín hiệu huỳnh quang được xác định bởi máy điện di mao quản không được sử dụng trực tiếp để tính toán số lượng bản sao, do tín hiệu này còn có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác nhau. Đầu tiên, cường độ tín hiệu huỳnh quang của mỗi đầu dò sẽ được chuẩn hoá trong mỗi mẫu. Sau đó, so sánh tín hiệu từ các mẫu khác nhau nhằm xác định mẫu nào có bản sao thay đổi bất thường. Những mẫu không có sự thay đổi nào về số lượng bản sao PAX6 sẽ cho hình ảnh đỉnh các tín hiệu của đầu dò giống với hình ảnh kết quả của mẫu đối chứng khoẻ mạnh. Tỉ lệ của tín hiệu các đầu dò sau bước chuẩn hóa thứ 2 sẽ là ~ 1. Đối với trường hợp mất đoạn dị hợp tử, tỉ lệ này ~ 0.5. Tỷ lệ cuối cùng được gọi là Dosage Quotient (DQ). Phần mềm Coffalyzer.net sẽ tính toán DQ cho từng đầu dò và đưa ra kết quả cuối cùng.