Việc xem xét tiền sử gia đình ở bệnh nhân nhi đã được chẩn đoán lâm sàng với KMM là cần thiết. Đối với các bất thường do đột biến PAX6 ở trẻ thì cha/mẹ nên được khám mắt ngay nếu cha/mẹ đã có tiền sử rõ ràng. Nếu bệnh nhân có cha/mẹ mắc bệnh tương tự khả năng có đột biến mất gen WT1 là thấp, tuy vậy đã có một số trường hợp hiếm được báo cáo [2, 70].
Đánh giá trạng thái phân tử PAX6
Mặc dù đột biến trong gen gặp phổ biến hơn ở bệnh nhân KMM so với đột biến mất đoạn, việc phân tích mất đoạn được khuyến cáo đầu tiên bởi vì tầm quan trọng của việc xác định mất đoạn WAGR trong lâm sàng. Phương pháp aCGH độ phân giải cao dùng cho kiểm tra vi mất đoạn chỉ yêu cầu một lượng nhỏ mẫu ADN giúp làm tăng hiệu quả và giảm chi phí của xét nghiệm. Những bệnh nhân không tìm ra được vi mất đoạn bằng các kỹ thuật như aCGH sẽ được kiểm tra các đột biến trong gen nhờ kỹ thuật giải trình tự (bao gồm cả công nghệ giải trình tự Sanger hoặc thế hệ mới) (hình 1.5). Tuy nhiên, phương pháp aCGH không phát hiện được những bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể mà không dẫn tới thay đổi số lượng bản sao. Một số phòng thí nghiệm vẫn dùng phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) để xác định đột biến cấu trúc NST mà phá vỡ chức năng PAX6 (không thay đổi bản sao) [2, 7]. Tuy nhiên, hiện nay công nghệ giải trình tự toàn bộ hệ gen có thể thay thế FISH cho xác định bất thường cấu trúc dạng cân bằng [71]. Bên cạnh đó sử dụng phương pháp MLPA có thể xác định mất đoạn tại các vùng đích [12]. Người ta cũng đã phát hiện ra mất đoạn hoặc lặp đoạn trên vùng 11p13 ở một gia đình mà có cha mẹ chuyển đoạn cân bằng [72].
23
Những trường hợp không có đột biến mất đoạn gen được phát hiện, nên thực hiện phân tích đột biến trong gen PAX6. Việc này có thể được yêu cầu bởi cha mẹ hoặc chính bệnh nhân sau khi đã được bác sĩ tư vấn về ý nghĩa của xét nghiệm di truyền. Các đột biến điểm trong gen được xác định bởi giải trình tự trực tiếp exon và các vùng nối exon-intron. Một số mất đoạn nhỏ trong gen cũng có thể xác định được bởi aCGH hoặc MLPA [12].
Chiến lược xét nghiệm di truyền được các chuyên gia đề xuất như sau (Hình 1.5):
• Sử dụng aCGH độ phân giải cao để kiểm tra vi mất đoạn đối với các trường hợp KMM được chẩn đoán mới.
• Nếu phát hiện đột biến mất đoạn, xác định mức độ chính xác.
• Kiểm tra mất đoạn của PAX6 và WT1 để xác nhận chẩn đoán hội chứng WAGR.
• Nếu không phát hiện mất đoạn, sử dụng kỹ thuật giải trình tự để sàng lọc đột biến trong vùng mã hoá PAX6.
• Nếu có họ hàng bị bệnh, kiểm tra xác định xem họ có mang cùng đột biến với bệnh nhân
• Nếu gia đình không có tiền sử, kiểm tra ADN cha mẹ để xác định liệu có phải đây là đột biến phát sinh mới hay không. Kiểm tra tình trạng khảm ở cha mẹ để dự đoán khả năng tái xuất hiện trong những đứa trẻ tiếp theo của họ.
Khi xác định được đột biến trên PAX6 gây bệnh sẽ giúp xác nhận chẩn đoán KMM đơn. Những cá thể mà âm tính trong những xét nghiệm này có thể có đột biến sâu trong vùng intron hoặc các thành phần vùng điều hoà. Ngoài ra, bệnh nhân có thể có các đột biến trong FOXC1, PITX2 hoặc PITX3 (hoặc các gen tiềm năng khác, vẫn chưa được xác định), gây ra kiểu hình tương đồng với KMM (Hình 1.5) [65, 73, 74].
24
Hình 1.5: Chiến lược xét nghiệm di truyền đối với những bệnh nhân khuyết mống mắt. Phân tích đột biến cấu trúc bằng công nghệ aCGH với độ
phân giải cao sẽ được sử dụng đầu tiên cho tất cả các bệnh nhân có chẩn đoán lâm sàng với KMM. Sau đó tuỳ thuộc vào kết quả của xét nghiệm này mà cần sử dụng thêm các xét nghiệm bổ trợ khác nhằm chẩn đoán chính xác nguyên nhân gây bệnh [3].
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH KHUYẾT MỐNG MẮT
Có khá nhiều nghiên cứu về KMM bẩm sinh trên thế giới được công bố trong những năm gần đây. Bốn hướng tiếp cận chính của các nghiên cứu KMM bao gồm: 1) xác định đột biến di truyền gây bệnh và bổ sung vào cơ sở dữ liệu; 2) tìm hiểu cơ chế gây bệnh của các dạng đột biến; 3) tìm hiểu về mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình ở người mắc bệnh; và 4) nghiên cứu về liệu pháp điều trị đối với những bệnh nhân mắc KMM bẩm sinh.
Phần lớn các nghiên cứu xác định đột biến di truyền gây bệnh KMM sử dụng hai phương pháp chính là giải trình tự Sanger và MLPA. Sự kết hợp của hai kỹ thuật này nhằm tìm kiếm đột biến trong gen PAX6 và mất đoạn vùng
25
11p13 để sàng lọc hội chứng WAGR [11]. Ngoài ra, một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật aCGH với độ phân giải cao và thiết kế riêng để sàng lọc locus 11p13 nhằm nâng cao hiệu quả tìm kiếm đột biến [9]. Hơn nữa, sử dụng droplet PCR các nhà khoa học còn phát hiện được tình trạng khảm đột biến PAX6 (đột biến phát sinh sau giai đoạn hợp tử) [75]. Sử dụng real time PCR nhiều tác giả đã chỉ ra nồng độ mRNA ở những bệnh nhân chứa đột biến mã kết thúc sớm có nồng độ bằng một nửa so với mẫu đối chứng. Từ kết quả này các tác giả cho rằng nguyên nhân gây bệnh đối với trường hợp đột biến tạo PCT là do mRNA bị phân huỷ theo cơ chế NMD [76]. Một nghiên cứu khác cũng đã chỉ ra cơ chế tương tự gây ra sự thiếu hụt protein PAX6 ở những bệnh nhân có đột biến điểm cắt. Điều này nghĩa là một số đột biến điểm cắt sau đó tạo ra mã kết thúc sớm và do đó mARN bị phân huỷ khiến lượng protein được sản xuất không đủ [60]. Ngoài ra, một số công cụ tin sinh học cũng được sử dụng trong nghiên cứu để dự đoán chức năng protein được sinh ra từ các gen lỗi nhằm tìm kiếm cơ chế gây bệnh KMM [77].
Hướng nghiên cứu đánh giá mối tương quan kiểu đột biến và sự biểu hiện bệnh cũng được một số tác giả trên thế giới quan tâm. Pedersen và cộng sự năm 2020 đã báo cáo nếu bệnh nhân có đột biến trong vùng mã hoá của gen PAX6 sẽ gây ra lớp bên ngoài võng mạc mỏng hơn so với đột biến vùng không mã hoá [78]. Ngược lại, cũng có nghiên cứu chưa phát hiện được bất cứ mối tương quan giữa kiểu đột biến và kiểu hình ở bệnh nhân mắt tật khuyết mống mắt [61].
Điều trị và chăm sóc đối với những bệnh nhân mắc chứng bệnh di truyền nói chung và tật khuyết mống mắt nói riêng được rất nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Đã có nghiên cứu nhằm tìm ra hướng điều trị cho bệnh nhân KMM mang đột biến vô nghĩa trên PAX6. Trong một thử nghiệm in vitro Liu và cộng sự có thể tăng việc sản xuất protein ở dòng tế bào bạch cầu từ người bệnh có đột biến PCT trên PAX6 lên tới 30-40% [79]. Hơn nữa, mô hình tế bào giác mạc mắc bệnh do khuyết mống mắt cũng đã được tạo ra bởi công nghệ CRISPR/Cas 9, đồng thời tác giả đã sử dụng protein PAX6 tái tổ hợp để chữa trị và kết quả thể hiện khá khả quan [80]. Tuy nhiên, vẫn cần nhiều
26
nghiên cứu cận lâm sàng và lâm sàng để có đủ bằng chứng cho việc ứng dụng những phương pháp điều trị này đối với bệnh nhân KMM.
Cho đến nay, ở Việt Nam có ba báo cáo nghiên cứu đề cập tới các trường hợp dị tật KMM. Trong đó, tác giả Phạm Thị Chi Lan là người đầu tiên báo cáo về 30 trường hợp bệnh nhân KMM tại Hội nghị nhã khoa toàn quốc năm 2008. Tuy nhiên, đây chỉ là một báo cáo nhận xét về bệnh này theo hồ sơ bệnh án của bệnh nhân tại Bệnh viện Mắt TP. Hồ Chí Minh từ năm 2000 tới 2007 [81]. TS. Lê Đỗ Thuỳ Lan tại Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch là tác giả thứ hai có đề cập tới dị tật KMM trong nghiên cứu của cô năm 2010. Trong nghiên cứu này bác sĩ Lan tính toán tỷ lệ của những kiểu dị tật mắt bẩm sinh chứ không thực hiện phân tích di truyền phân tử của bệnh [82]. Báo cáo thứ ba về KMM do TS. Vũ Thị Bích Thuỷ và cộng sự tại Bệnh viện Mắt trung ương đăng trên tạp chí Nhãn khoa Việt Nam năm 2010. Bệnh nhân nhập viện do tình trạng tăng nhãn áp nặng (Glôcôm), sau đó được chẩn đoán KMM bẩm sinh [83]. Tuy nhiên, giống như hai công trình ở trên nghiên cứu này cũng không thực hiện chẩn đoán phân tử để tìm đột biến gây ra tình trạng KMM ở bệnh nhân.
27
CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN VẬT LIỆU