Kỹ thuật MLPA được áp dụng cho toàn bộ 14 mẫu bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu nhằm phát hiện đột biến cấu trúc của vùng 11p13-14. Sử dụng kỹ thuật điện di mao quản để phân tích sản phẩm sau phản ứng MLPA. Do đó, kết quả phân tích được thể hiện dưới dạng bảng số liệu và điện di đồ (electropherogram). Mỗi sản phẩm khuếch đại của một đầu dò được thể hiện bằng một đỉnh tín hiệu (peak). Phần mềm trên máy phân tích sẽ tính ra kích thước của các băng được khuếch đại bằng cách so sánh các đỉnh tín hiệu trong mẫu bệnh phẩm và và tín hiệu khi chạy thang kích thước chuẩn (LIZ-GS 500). Hơn nữa, kết quả chạy mẫu bệnh phẩm cũng được so sánh với mẫu đối chứng người khoẻ mạnh, từ đó tính ra tỷ lệ DQ (Dosage quotients). Chiều cao mỗi băng tín hiệu thay đổi cho thấy sự thay đổi bản sao ADN có trình tự bổ
40
sung với đầu dò tương ứng. Bảng 3.3 trình bày các thông số về mối tương quan giữa số bản sao ADN và sự phân bố của giá trị DQ do nhà sản xuất đưa ra (số bản sao là 2 được coi là bình thường). Ngoài ra, kết quả của phân tích được coi là đáng tin cậy khi độ lệch chuẩn (standard deviation) của mỗi đầu dò trong mẫu đối chứng nhỏ hơn 10%. Nếu tín hiệu từ các đầu dò trong các exon liền kề cùng tăng hoặc cùng giảm là thể hiện mất/hoặc lặp nhiều đoạn exon liền kề nhau. Ngược lại, kết quả được cho là không đáng tin cậy khi các đầu dò bổ sung với exon không liền kề cho tín hiệu cùng tăng hoặc giảm. Hoặc các đầu dò chuẩn (reference probes) trong cùng một mẫu cho ra số lượng bản sao bất thường.
Bảng 3.3: Bảng mối liên hệ giữa giá trị DQ và số lượng bản sao
Phân bố giá trị DQ Số bản sao
DQ = 0 0 bản sao (mất đoạn đồng hợp tử) 0.4 < DQ < 0.65 2 => 1 bản sao (mất đoạn dị hợp tử)
0.8 < DQ < 1.2 2 bản sao – Bình thường 1.3 < DQ < 1.65 2 => 3 bản sao (lặp đoạn dị hợp tử 1.75 < DQ < 2.15 2 => 4 bản sao
Phân tích MLPA đối với mẫu của 14 bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu đều cho kết quả rõ ràng. Có 12 trên 14 bệnh nhân âm tính với xét nghiệm MLPA. Điều này có nghĩa rằng không có bất cứ mất đoạn nào trên vùng gen được sàng lọc (vùng 11p13 bao gồm: PAX6, WT1, ELP4…). Kết quả MLPA điển hình của mẫu âm tính được trình bày trong hình 3.2 bên dưới.
41
(A) (B)
Hình 3.2: Kết quả phân tích MLPA của bệnh nhân TMM4. Đây là kết
quả một mẫu điển hình âm tính với MLPA. A) Hình ảnh kết quả phân tích đoạn trên máy điện di mao quản. Tất cả các các lô-cút được thiết kế đều được khuếch đại thành công và cho tín hiệu rõ ràng trên biểu đồ. Hình A phía dưới là biểu đồ trực quan thể hiện số lượng bản sao của mỗi lô-cút. Tất cả các vùng gen được phân tích đều có đầy đủ hai bản sao, không có mất đoạn và lặp đoạn xảy ra. B) Bảng kết quả thông số chi tiết quá trình phân tích mẫu. Trị số DQ được phần mềm COFFALYSER tính toán dựa trên sự so sánh tỷ lệ tín hiệu với mẫu tham khảo. Giá trị DQ nằm hoàn toàn trong khoảng 0.8 tới 1.2 (khung màu đỏ). Điều này có nghĩa rằng không có hiện tượng thay đổi số lượng bản sao vùng ADN được kiểm tra.
42
Kết quả phân tích MLPA cho thấy mẫu TMM2 bị mất ba locus nằm trên hai gen DCDC1 và ELP4 và mẫu TMM12 bị mất toàn bộ gen PAX6, tất cả đều mất ở dạng dị hợp tử (mất 1 allele). Bảng số liệu tỉ lệ DQ cho thấy các giá trị DQ nằm từ 0.56-0.68. Kết quả biểu đồ sóng cũng cho thấy các đỉnh tín hiệu của các hai gen này đều thấp hơn một nửa so với mẫu đối chứng (Hình 3.3 A,B).
(A) (B)
Hình 3.3: Kết quả phân tích MLPA của hai mẫu có đột biến mất đoạn. A) Biểu đồ điện di và hình ảnh thể hiện số lượng bản sao mỗi lô-cút
của mẫu TMM12. Tất cả các lô-cút đều được khuếch đại thành công và cho tín hiệu rõ ràng. Hình ảnh cho thấy mẫu TMM2 có 3 lô-cút chỉ có một bản sao (ba điểm trong khung màu đỏ ở phía dưới). Ba lô-cút bị mất bao gồm hai vị trí trên gen DCDC1 và một trên ELP4. B) Biểu đồ điện di và hình ảnh thể hiện số lượng bản sao của mỗi lô-cút được kiểm tra trong mẫu TMM12. Tất cả các băng điện di tương ứng với từng lô-cút được thiết kế cho tín hiệu rõ ràng. Hình ảnh thể hiện toàn bộ các lô-cút tương ứng với phần exon của
43
PAX6 và một số vùng ngược dòng với gen có một bản sao duy nhất (các điểm
trong khung màu đỏ bên dưới hình B).
Kết quả phân tích MLPA cho thấy có 2 trong 14 (14.28%) bệnh nhân có đột biến mất đoạn gen đều ở trạng thái dị hợp tử. Trong đó, mẫu TMM2 bị mất đoạn trong vùng không dịch mã 3’ UTR của gen PAX6 (Hình 3.3A). Đột biến này không phát hiện được ở mẫu bố mẹ của bệnh nhân. Ngược lại, mẫu TMM12 bị mất toàn bộ gen PAX6 (Hình 3.3B). Kiểm tra mẫu bố mẹ của bệnh nhân đã xác định đột biến mất đoạn này được truyền từ người mẹ cũng bị KMM.