Máy móc, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu này thuộc Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Một số thiết bị được sử dụng chính yếu trong nghiên cứu bao gồm: Máy ly tâm Eppendorf (Đức) và máy ly tâm lạnh đa năng 5810R* (Đức); Máy PCR Mastercycler pro S (Đức); Máy soi gel và chụp ảnh tự động DigiDoc-It® Imaging System của Ultra-violet production (Mỹ); Máy đo 24 quang phổ (UV- Vis BioSpectrometer Basic, Đức); Máy giải trình tự gen ABI 3500 Genetic Analyzer của hãng Applied Biosciences (Mỹ).
• Tách chiết ADN: Sử dụng bộ kít tách chiết ADN từ máu ngoại vi E.Z.N.A.® Blood DNA Mini Kit của hãng OMEGA Bio-tek, Mỹ.
• Điện di: Gel agarose của Affymetrix, Cleveland, Mỹ; Dung dịch TAE 1X; Loading Buffer 6X; Ethidium bromide.
28
• Hoá chất PCR: Taq 2X Master Mix của New England Biolab, Mỹ; dNTPs, nước 3D (deionized double distilled (3D) water) và DMSO từ hãng bioWORLD, Mỹ; Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu này được tổng hợp và cung cấp bởi công ty Sinh hoá Phù Sa, Cần Thơ, Việt Nam.
• Hoá chất tinh sạch sản phẩm sau PCR: Sử dụng kit Gen JETTM PCR purification của Thermo Scientific, Mỹ.
• Hoá chất giải trình tự: Ethanol của Merk, Mỹ; Kit giải trình tự Big Dye Terminator v3.1 của Applied Biosciences.
• Hoá chất phản ứng MLPA: Bộ kit SALSA MLPA Probemix P219 PAX6 (MRC-Holland, Amsterdam, Hà Lan).
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ như sau:
Hình 2.1: Sơ đồ phương pháp nghiên cứu.
Bước 1
• Thu 2 ml máu tĩnh mạch của bệnh nhân vào ống chống đông chứa EDTA (K2-K3)
Bước 2
• Tách chiết ADN tổng số bằng kít E.Z.N.A.® Blood DNA Mini Kit • Xác định nồng độ ADN sau tách chiết bằng máy Qubit Fluorometer
Bước 3
• Thực hiện phân tích mất đoạn theo phương pháp MLPA sử dụng kít SALSA MLPA Probemix P219 PAX6
Bước 4
• PCR các vùng exon, vùng nối intron exon, và vùng promoter • Giải trình tự gen
29