Trình tự gen thu được của mẫu nghiên cứu được so sánh với trình tự cDNA chuẩn (mã số NM_001258464.1, Genbank) của PAX6 và trình tự gen của mỗi đoạn PCR theo thiết kế (Hình 3.5 – 3.9).
430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
PAX6_cDNA_NM_001258464.1 CGAGCCCCGTGGAATCCCGCGGCCCCCAGCCAGAGCCAGCATGCAGAACAGTCACAGCGGAGTGAATCAGCTCGGTGGTGTCTTTGTCAACGGGCGGCCACTGCC
PAX6_E5: .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM1_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM2_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM3_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM4_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM5_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM6_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM7_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM8_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM9_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM10_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM11_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM11Me_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM11OFF1_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM11S1_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM11S1-OFF1_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM13_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM14_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... TMM15_PAX6_E5 .TGCT.T.T.CTCT..TTTTCC..TTTCCT.TCCT.TCC.T.T.CTC.-G....................................................... 530 540 550 560 570 580 590 600 610 620 630 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
PAX6_cDNA_NM_001258464.1 GGACTCCACCCGGCAGAAGATTGTAGAGCTAGCTCACAGCGGGGCCCGGCCGTGCGACATTTCCCGAATTCTGCAGGTGTCCAACGGATGTGTGAGTAAAATTCT
PAX6_E5: ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM1_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM2_PAX6_E5 .............................................................-.................AT.CT..CGCCGCC.CCCC.CTCG.C TMM3_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM4_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM5_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM6_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM7_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM8_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM9_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM10_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C
TMM11_PAX6_E5 ..............................................S.S.S.KSSA.MW.....SA.....G.MR..GAAT.CT.CCGGSGCC.CCC..TTCS.G TMM11Me_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM11OFF1_PAX6_E5 ..............................................S.S.G.GSSA.MT........T.CT..MR..GAA..CT.C.GGSSCCSCCCCCTTCS.C TMM11S1_PAX6_E5 ..............................................S.S.G.GSSAMMT.....SA...CTG.MR.KGAA..TT.C.GS.GCGSCCC.MTTSS.G TMM11S1-OFF1_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM13_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM14_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C TMM15_PAX6_E5 ...............................................................................AT.CT.CCGGCGCC.CCCC.CTCG.C
Hình 3.5: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 5 của gen PAX6 trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn. PAX6_cDNA_NM_001258464.1
45
trình tự chuẩn trên ngân hàng gen. PAX6_E5 trình tự vùng biên và exon 5 theo lý thuyết được khuếch đại bởi cặp mồi E5F và E5R trong nghiên cứu. TMM_PAX6_E5 trình tự vùng biên intron và exon E5 của bệnh nhân và người thân tham gia trong nghiên cứu. Tất cả các mẫu nghiên cứu được khuếch đại và giải trình tự thể hiện chính xác vùng exon E5 và vùng biên intron theo thiết kế. Vùng exon tương đồng với trình tự chuẩn trên ngân hàng gen. Vùng biên intron không tương đồng do cDNA không chứa trình tự intron. Kết quả đọc trình tự cho thấy nucleotide 572 trên trình tự của bệnh nhân TMM11 là S (C và G) so với trình tự chuẩn là C, đồng thời các vị trí sau đó hầu hết đều ở trạng thái 2 nucleotide (Vùng hình chữ nhật được khoanh trên hình). Điều này chỉ ra rằng mẫu TMM11 có đột biết mất một nucleotide C ở trạng thái dị hợp tử. Kiểm tra những người trong đại gia đình bệnh nhân TMM11 phát hiện đột biến tương tự ở những người mắc KMM (con gái bệnh nhân mã TMM11OFF1_PAX6_E5, chị gái TMM11S1_PAX6_E5). Trong khi đó những người không mang tật KMM có trình tự bìn thường và hoàn toàn giống với các mẫu khác và trình tự chuẩn (mẹ đẻ bệnh nhân mã
TMM11Me_PAX6_E5, cháu gái mã TMM11S1-OFF_PAX6_E5).
780 790 800 810 820 830 840 850 860 870 880 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
PAX6_cDNA_NM_001258464.1 AGATTACTGTCCGAGGGGGTCTGTACCAACGATAACATACCAAGCGTGTCATCAATAAACAGAGTTCTTCGCAACCTGGCTAGCGAAAAGCAACAGATGGGCGCAGACGGCATGT
TMM1_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT---.G.TT.G.AG---...................................................................
TMM2_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT---.G.TT.G.AG---...................................................................
TMM3_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT---.G.TT.G.AG---...............KY.YY..RMMCTG..TA...AA....RA....TG.....R..C.S..TG...
TMM3Bo_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTT-.A.T.TGGTT---.G.TT.G.AG---...................................................................
TMM3Me_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT---.G.TT.G.AG---...................................................................
TMM4_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT---.G.TT.G.AG---...................................................................
TMM5_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT---.G.TT.G.AG---...................................................................
TMM6_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT---.G.TT.G.AG---...................................................................
TMM7_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT---.G.TT.G.AG---...................................................................
TMM8_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT---.G.TT.G.AG---...................................................................
TMM9_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT---.G.TT.G.AG---...................................................................
TMM10_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT---.G.TT.G.AG---...................................................................
TMM11_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGKTT---.G.TT.G.AG---...................................................................
TMM13_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT---.G.TT.G.AG---...................................................................
TMM14_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT---.G.TT.G.AG---...................................................................
TMM15_PAX6_E7 .C.C...CA.TT.GTTT.A.T.TGGTT---.G.TT.G.AG---...................................................................
890 900 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
PAX6_cDNA_NM_001258464.1 ATGATAAACTAAGGATGTTGAACGGGCAGACCGGAAGCTGGGGCACCCGCCCTGGTTGGTATCCGGGGACTTCGGTGCCAGGGCAACCTACGCAAGATGGCTGCCAGCAACAGGA
TMM1_PAX6_E7 ..............................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT
TMM2_PAX6_E7 ..............................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT
TMM3_PAX6_E7 G......TA..GA.G..GA......RS.C....A..TG...SA.C...C.TG..TG..A.......ACTT...K.C...G..AACCT....RAGG.GAAAACC..RMAC..MTCT
TMM3Bo_PAX6_E7 ..............................................................................................G-AAAAC...AGC.GCCAT TMM3Me_PAX6_E7 ..............................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM4_PAX6_E7 ..............................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM5_PAX6_E7 ..............................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM6_PAX6_E7 ..............................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM7_PAX6_E7 ..............................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM8_PAX6_E7 ..............................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM9_PAX6_E7 ..............................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM10_PAX6_E7 ..............................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM11_PAX6_E7 ..............................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM13_PAX6_E7 ..............................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM14_PAX6_E7 ..............................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT TMM15_PAX6_E7 ..............................................................................................G.AAAAC...AGC.GCCAT
Hình 3.6: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 7 của gen PAX6 trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn. PAX6_cDNA_NM_001258464.1
46
_PAX6_E7 trình tự vùng biên intron và exon E7 của bệnh nhân và người thân tham gia trong nghiên cứu. Vùng exon tương đồng với trình tự chuẩn trên ngân hàng gen. Vùng biên intron không tương đồng do cDNA không chứa trình tự intron. Kết quả phân tích cho thấy nucleotide 834 trên trình tự của bệnh nhân TMM3 là K (G và T), trong khi đó điểm này trên trình tự chuẩn là G. Đồng thời hầu hết các tín hiệu giải trình tự sau vị trí này đều chồng lấn lên nhau và thể tín hiệu của hai nucleotide cùng vị trí. Tiến hành phân tích sâu hơn cho thấy mẫu TMM3 mang đột biến dịch khung do mất 2 nucleotide G và T tại vị trí c.375-376. Trên hình cũng thể hiện kết quả giải trình tự mẫu cha mẹ của bệnh nhân TMM13 (TMM13Me_PAX6_E7 và TMM13Bo_PAX6_E7). Mẫu bố mẹ bệnh nhân mang trình tự bình thường do vậy đột biến này mới phát sinh ở đời con.
920 930 940 950 960 970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040. 1050 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| PAX6_cDNA_001258464.1G-GCAGACC--GGAAGCTGGGGCACCCGCCCTGGTTGGTATCCGGGGACTTCGGTGCCAGGGCAACCTACGCAAGATGGCTGCCAGCAACAGGAAGGAGGGGGAGAGAATACCAACTCCATCAGTTCCAACGGAGAAGAT PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................. TMM1_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................. TMM2_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................. TMM3_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................. TMM4_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................. TMM5_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................Y................................................ TMM5Bo_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................. TMM5Me_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................. TMM6_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................. TMM7_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................. TMM8_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................. TMM9_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................. TMM10_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................. TMM11_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C................................................................. TMM13_PAX6_E8 ACA.CAGG.--CCCTTT...A.GCT..AAGT.AA.CCAA..TTCT---...ACCAT..TATT.TTTT.GTT.C.................................................................
TMM14_PAX6_E8 CCM.C.GG.--CCTTTTK....STT.AAAGT.AT.CCAA..TTTT---Y.WMCC.T.TTTTTTTTTTKGTT.CGA.K.SYKS.ARSM.MMR.R.R.RR........................................
TMM15_PAX6_E8 CCC.CAGS.--CCYTTTG.RR.SYT..AAGT.AW.CCAAW.TTTT---Y..MCC.Y.TTTTTTTTTT.TTY.CGA.K.SYKS...S..C.R.R.R.RR........................................
1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
PAX6_cDNA_001258464.1TCAGATGAGGCTCAAATGCGACTTCAGCTGAAGCGGAAGCTGCAAAGAAATAGAACATCCTTTACCCAAGAGCAAATTGAGGCCCTGGAGAAAGAGTTTGAGAGAACCCATTATCCAGATGTGTTTGCCCGAGAAAGACT
PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---.....GC.G. TMM1_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---.....GC.G. TMM2_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---.....GC.G. TMM3_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---.....GC.G. TMM4_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---.....GC.G. TMM5_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---.....GC.G. TMM5Bo_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---.....GC.G. TMM5Me_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---.....GC.G. TMM6_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---.....GC.G. TMM7_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---.....GC.G. TMM8_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---.....GC.G. TMM9_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---.....GC.G. TMM10_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---.....GC.G. TMM11_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---.....GC.G. TMM13_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---.....GC.G. TMM14_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---.....GC.G. TMM15_PAX6_E8 ..............................................................................................G---...T...GT---..T..A.AG.A---.....GC.G.
Hình 3.7: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 8 của gen PAX6 trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn. PAX6_cDNA_001258464.1 trình tự
chuẩn trên ngân hàng gen với mã truy cập 001258464.1. PAX6_E8 trình tự vùng biên và exon 8 theo lý thuyết được khuếch đại bởi cặp mồi E8F và E8R trong nghiên cứu. TMM-_PAX6_E8 trình tự vùng biên intron và exon E8 của bệnh nhân và người thân tham gia trong nghiên cứu. Vùng exon tương đồng với trình tự chuẩn trên ngân hàng gen. Vùng biên intron không tương đồng do cDNA không chứa trình tự intron. Kết quả so sánh trình tự cho thấy mẫu
47
ADN của bệnh nhân TMM5 xuất hiện đột biến điểm tại vị trí 1000 so với trình tự chuẩn. Đây là dạng đột biến thay thế nucleotide dị hợp tử (C T). Đột biến này tạo ra mã kết thúc sớm. Kiểm tra và phân tích ADN của bố và mẹ bệnh nhân cho thấy trình tự ADN bình thường giống như trình tự tham khảo. Tương tự, kết quả phân tích trình tự exon 8 đã giúp phát hiện đột biến ADN trong mẫu của bệnh nhân TMM14 và TMM15. Đây là đột biến them nucleotide dẫn đến làm dịch chuyển khung đọc mở. Cụ thể, từ nucleotide 987 theo trình tự tham khảo có xuất hiện biến đổi. Mỗi vị trí thường có tín hiệu của hai nucleotide, đây là dấu hiệu của đột biến làm dịch khung đọc mở ở dạng dị hợp tử. Phân tích kết quả phát hiện ra đột biến thêm một nucleotide G vào vị trí 987 (c.551insG). Hai mẫu TMM14 và TMM15 có đột biết giống hệt nhau. Xem trong khung hình ovan.
1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 1210 1220 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
PAX6_cDNA_NM_001258464.1CCCAAGAGCAAATTGAGGCCCTGGAGAAAGAGTTTGAGAGAACCCATTATCCAGATGTGTTTGCCCGAGAAAGACTAGCAGCCAAAATAGATCTACCTGAAGCAA
PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC...................................................................... TMM1_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC........................................................................ TMM2_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC........................................................................ TMM3_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC........................................................................ TMM4_PAX6_E9 TGG..A-T...C..-.---.TC--TTTC........................................................................ TMM5_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC........................................................................ TMM6_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC........................................................................ TMM7_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC........................................................................ TMM8_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC........................................................................ TMM9_PAX6_E9 TGG..A.T...C..-.---.TC--TTTC........................................................................