bệnh nhân
Có 77,78% bệnh nhân đã xác định được đột biến di truyền liên quan đến gen PAX6 bao gồm cả mất đoạn vùng điều hoà 3’UTR biểu hiện rung giật nhãn cầu. Bên cạnh đó, 66,67% bệnh nhân biểu hiện với tình trạng thiểu sản hoàng
50
điểm. Ngược lại, hầu hết các bệnh nhân không gặp phải tình trạng đục thuỷ tinh thể, tăng nhãn áp và tổn thương giác mạc. Chỉ duy nhất một bệnh nhân với đột biến mất toàn bộ gen có biểu hiện tăng nhãn áp và đục giác mạc (Bảng 3.5). Có thể do mất toàn bộ gen mà việc sản xuất protein PAX6 chỉ diễn ra trên alen còn lại nên bệnh nhân này có biểu hiện nặng hơn bao gồm cả đục giác mạc, suy hố thị giác và rụng giật nhãn cầu. Mặc dù chúng tôi chưa phát hiện ra sự khác biệt giữa các bệnh nhân trong mối tương quan giữa kiểu đột biến gen và kiểu hình tương ứng. Tuy nhiên, chúng tôi xác nhận rằng tình trạng KMM do đột biến PAX6 thường đi kèm các biểu hiện khác liên quan như rung giật nhãn cầu và thiểu sản hoàng điểm.
Bảng 3.5: Đột biến và kiểu hình ở mỗi bệnh nhân
Mã BN Exon/
intron Vị trí đột biến Loại đột biến Thị lực
Rung giật nhãn cầu Thiểu sản hoàng điểm Đục Thuỷ tinh thể Tăng nhãn áp Tổn thương giác mạc TMM2 3’UTR Mất
đoạn LE: 20/100 RE: PL (-) Không Không Không Không Không TMM3 Exon 7 c.375-376delAG Dịch
khung
RE: 20/100
LE: 20/100 Có Có Không Không Không TMM5 Exon 8 c.538C>T; nghĩa Vô NO CO.OP Có Có Không Không Không
TMM9 Intron 9 c.765+1G>A Điểm
cắt NO CO.OP Có Không Không Không Không TMM11 Exon 6 c.112delC Dịch khung RE: 20/200
LE: 20/400 Có Không Không Không Không TMM12 Toàn bộ gen
Mất
đoạn NO CO.OP Không Có Không Có Đục GM TMM13 Exon 11 c.C949T nghĩa Vô NO CO.OP Có Có Không Không Không
TMM14 Exon 8 c.547insG Dịch
khung NO CO.OP Có Có Không Không Không TMM15 Exon 8 c.547insG Dịch
khung NO CO.OP Có Có Không Không Không
51 THẢO LUẬN
Khuyết mống mắt là dị tật bẩm sinh mà biểu hiện bởi khuyết một phần hoặc toàn bộ mô mống mắt, đồng thời có suy hố thị giác dẫn đến giảm thị lực ở bệnh nhân. Khuyết mống mắt có thể là bệnh độc lập hoặc biểu hiện cùng với các bất thường hệ thống khác như trong trường hợp hội chứng WAGR. Đối với bệnh nhân mắc hội chứng WAGR nguy cơ xuất hiện khối u Wilms ở thận rất cao. Việc kiểm tra và tầm soát thường xuyên sự phát sinh khối u Wilms ở thận của bệnh nhân nhi cho tới khi bệnh nhân lên 8 tuổi là rất quan trọng. Hội chứng này gây bởi mất đoạn các gen giáp bao gồm PAX6 và WT1
nằm trên vùng 11p13-14. Do đó, chiến lược tiếp cận khi chẩn đoán di truyền đối với những bệnh nhân có biểu hiện KMM là ưu tiên sàng lọc mất đoạn gen vùng 13 trên cánh dài nhiễm sắc thể số 11. Vì thế, chúng tôi lựa chọn MLPA là xét nghiệm đầu tiên sử dụng cho tất cả bệnh nhân khuyết mống mắt tham gia vào trong nghiên cứu này. Bộ kít SALSA MLPA Probemix P219 PAX6 chúng tôi sử dụng bao gồm 44 đầu dò bao phủ toàn bộ gen PAX6 và cả gen
WT1. Kết quả phân tích có thể phân định được vùng mất đoạn có hay không có bao gồm WT1, điều này quan trọng cho việc quản lý bệnh nhân sau xét nghiệm. Trong nghiên cứu này, phân tích MLPA cho thấy toàn bộ 14 bệnh nhân của chúng tôi đều không có mất đoạn gen WT1. Kết quả này khẳng định tất cả bệnh nhân KMM trong nghiên cứu không mắc hội chứng WGRA. Điều này cũng có nghĩa nguy cơ về phát sinh khối u Wilms ở thận là thấp và tần số xuất hiện tương tự như trong quần thể chung. Kết quả này có ý nghĩa quan trọng cho việc theo dõi sức khoẻ và thăm khám của bệnh nhân.
Nghiên cứu này xác định được 2 bệnh nhân có mất đoạn gây ảnh hưởng
PAX6 và dẫn đến biểu hiện bệnh KMM. Trong đó, bệnh nhân đầu tiên có mất đoạn vùng điều hoà và không dịch mã 3’ UTR của gen PAX6. Bệnh nhân chỉ có biểu hiện KMM và không kèm theo các biểu hiện liên quan như rung giật nhãn cầu, đục giác mạc và thiểu sản hoàng điểm… Việc phát hiện đột biến mất đoạn ADN không nằm trong vùng mã hóa gen PAX6 là nguyên nhân gây nên dị tật KMM ở bệnh nhân TMM2 có thể hợp lý. Tình trạng mất đoạn không liên quan đến gen PAX6 ở những bệnh nhân mắc bệnh KMM đã được
52
mô tả trước đây bởi một số tác giả [75 – 77]. Khi mất đoạn không bao gồm trình tự mã hóa PAX6, thì được gọi là “hiệu ứng vị trí”, một cơ chế gây bệnh tiềm ẩn của dị tật mống mắt. Phân tích MLPA cho thấy ở những bệnh nhân này có hiện tượng mất đoạn dị hợp tử ở một số gen, bao gồm cả gen ELP4. Kleinjan và cộng sự đã xác nhận rằng các yếu tố điều hòa cis nằm trong các intron của gen ELP4 là các yếu tố kiểm soát tầm xa đặc hiệu PAX6 (specific long-range control elements), rất cần thiết cho sự biểu hiện bình thường của gen. Ngoài ra, một số nghiên cứu chức năng trên tế bào người và mô hình động vật cũng chỉ ra sự hiện diện của 3 yếu tố điều hòa ở vùng downstream
PAX6, cần thiết cho sự biểu hiện bình thường của gen [31]. Phát hiện phân tử của chúng tôi cung cấp thêm bằng chứng về vai trò của các yếu tố điều hoà bên ngoài vùng mã hoá của gen PAX6, như đã được các nghiên cứu khác báo cáo là ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện protein. Trường hợp còn lại mắc bệnh do mất toàn bộ gen PAX6, đây là một bệnh nhân nhi sinh năm 2020. Do mất toàn bộ một alen nên việc sản xuất protein chỉ diễn ra trên alen còn lại, đây có thể là nguyên nhân khiến cho bệnh nhân này biểu hiện nặng hơn bao gồm đục giác mạc, thiểu sản hoàng điểm và rung giật nhãn cầu. Tuy vậy, có một điều may mắn là cả hai bệnh nhân có phát hiện mất đoạn gen chỉ liên quan đến
PAX6 và không mất đoạn với WT1, nguy cơ mắc khối u Wilms tương tự như
với quần thể chung.
Bên cạnh mất đoạn vùng 11p13, đột biến PAX6 vẫn được cho là nguyên nhân chính gây ra bệnh khuyết mống mắt. Đã có một cơ sở dữ liệu về các đột biến trên PAX6 liên quan tới bệnh KMM được thành lập với gần 500 biến dị. Có tới 96% đột biến nằm trong gen PAX6, 4% còn lại thuộc các vùng không mã hoá bao gồm vùng điều hoà 3’ UTR và 5’ UTR. Trong nghiên cứu này nhờ giải trình tự chúng tôi xác định được 7 trên 12 mẫu có đột biến nội gen PAX6 sau khi âm tính với kết quả MLPA. Trong số đột biến được xác định phần lớn là dạng dịch khung do mất hoặc chèn nucleotide vào khung đọc mở của PAX6 (4/7). Tất cả các đột biến dịch khung này đều tạo ra mã kết thúc sớm (PCT) ngay sau điểm đột biến khoảng vài chục nucleotide. Như vậy 6/7 (85.71%) trường hợp đột biến nội gen tạo ra mã kết thúc sớm và gây ra kiểu hình khuyết mống mắt. Tỷ lệ này cũng khá tương đồng với những gì
53
được báo cáo trên cơ sở dữ liệu LOVD về đột biến PAX6 (70%). Người ta đã chứng minh rằng những đột biến tạo ra mã kết thúc sớm sẽ không tạo ra những protein bị cắt ngắn mà sẽ không tạo ra sản phẩm protein do sự phân huỷ ARN qua trung gian vô nghĩa. Cũng có thể vì lý do này mà kiểu hình của các đột biến dịch khung, vô nghĩa hoặc mất toàn bộ gen khá tương đồng. Hầu hết các bệnh nhân đều có hiện tượng rung giật nhãn cầu và thiểu sản hoàng điểm bên cạnh bất thường mống mắt.
Nghiên cứu này đã thực hiện khai thác tiền sử bệnh trong gia đình kết hợp với kiểm tra sự hiện diện của đột biến gen phát hiện được trên bệnh nhân đối với các thành viên gia đình trong trường hợp họ đồng ý tham gia nghiên cứu. Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra đột biến gen của bố mẹ các bệnh nhân dương tính với đột biến gen gây bệnh. Kết quả là 6/9 cặp bố mẹ được kiểm tra không mang đột biến gen, điều này phù hợp với kết quả khai thác tiền sử bệnh trong gia đình của tất cả 6 bệnh nhân này đều không có người bị bệnh. Ba trong số chín trường hợp còn lại (33%) báo cáo tiền sử gia đình đã có người mắc bệnh tương tự. Kết quả xét nghiệm di truyền đối với mẫu cha mẹ và người thân của ba bệnh nhân tái khẳng định sự di truyền của đột biến trong những trường hợp này. Đối với hai trường hợp TMM12 và TMM14, những đột biến này mới xuất hiện trong hai thế hệ gần đây. Bệnh nhân TMM12 mang đột biến mất toàn bộ gen PAX6 là do được di truyền từ người mẹ đã xuất hiện đột biến tương tự. Bệnh nhân TMM12 tuy mới 1 tuổi nhưng bệnh biểu hiện khá nặng bao gồm thiểu sản hoàng điểm, đục giác mạc và tăng nhãn áp. Điều này có thể do sự ảnh hưởng của đột biến mất toàn bộ gen. Ngược lại, bệnh nhân TMM14 mang một đột biến dịch khung do được di truyền từ người cha. Hai cha con đều có biểu hiện rung giật nhãn cầu và thiểu sản hoàng điểm, các triệu trứng còn lại chưa thấy xuất hiện. Tất cả những người thân khác cùng thế hệ hoặc ở đời trên với cha mẹ hai bệnh nhân này đều được báo cáo không xuất hiện bệnh tương tự.
54
(A) (B)
Hình 3.10: So sánh kết quả phân tích MLPA của bệnh nhân TMM12 (A) và người mẹ cũng mắc KMM (B). Biểu đồ phân tích đoạn của cả hai
mẫu cho thấy tất cả các đầu dò đã gắn trúng đích và khuếch đại sản phẩm có kích thước đúng như thiết kế của bộ kít. Cường độ tín hiệu của mỗi băng được so sánh với mẫu chuẩn của người khoẻ mạnh từ đó tính ra tỷ lệ DQ. Dựa vào chỉ số này phần mềm sẽ chỉ ra lô-cút nào mất hoặc lặp trên nhiễm sắc thể. Hai biểu đồ bên dưới thể hiện trực quan tỷ lệ DQ tính toán được với mỗi lô- cút được khuếch đại bởi đầu dò tương ứng. Như vậy, có thể thấy toàn bộ 17 vị trí bao phủ trên gen PAX6 có tỷ lệ DQ<0.65 đối với mẫu bệnh nhân TMM12. Điều này chỉ ra rằng bệnh nhân có mất đoạn toàn bộ gen PAX6 ở trạng thái dị hợp tử. Hơn nữa, biểu đồ bên dưới hình B cũng cho thấy kết quả tương tự với mẫu của người mẹ (TMM12Me).
Trường hợp khuyết mống mắt do di truyền cuối cùng thuộc gia đình bệnh nhân TMM11. Kết quả giải trình tự cho thấy mẫu TMM11 mang đột biến c.112delC làm dịch khung đọc mở và tạo mã kết thúc sớm. Bệnh nhân báo cáo bệnh xuất hiện từ đời ông nội và được truyền cho nhiều người trong
55
gia đình bao gồm bố đẻ của bệnh nhân (Hình 3.11). Ngoài ra, chị gái ruột, hai bác gái và con gái bệnh nhân TMM11 cũng mắc tật khuyết mống mắt tương tự. Bệnh biểu hiện trong đại gia đình bao gồm thị lực kém và rung giật nhãn cầu, những triệu chứng khác chưa thấy xuất hiện. Kết quả phân tích di truyền đối với mẫu của con gái (mắc bệnh), chị gái (mắc bệnh), mẹ đẻ (không mắc bệnh) và con gái của chị gái (không mắc bệnh) cho thấy kết quả đột biến c.112delC xuất hiện dạng dị hợp tử ở những người mắc bệnh. Bệnh nhân báo cáo người cha có mắc KMM bẩm sinh tuy nhiên, ông đã mất nên không thể thực hiện phân tích di truyền trong nghiên cứu. Kết quả này một lần nữa khẳng định tình trạng dị tật mống mắt bẩm sinh trong gia đình TMM11 là do di truyền phát sinh từ đời trước.
Hình 3.11: Sơ đồ phả hệ của bệnh nhân TMM11. Bệnh nhân TMM11
tham gia vào trong nghiên cứu và được xác định mang đột biến c.112delC trên gen PAX6. Đột biến này làm lệch khung đọc mở và tạo mã kết thúc sớm. Phả hệ trên đây được xây dựng từ việc khai thác tiền sử gia đình bệnh nhân. Theo đó, dị tật KMM đã xuất hiện trong tổng thể 4 đời trong phả hệ. Một số người thân của bệnh nhân như mẹ đẻ, con gái, chị gái, và cháu gái cũng được lấy mẫu máu để xét nghiệm cho gen PAX6. Kết quả trên những người thân mắc bệnh (chị gái và con gái) cũng xác nhận mang đột biến tương tự với bệnh
56
Có 5 trong số 14 bệnh nhân (35%) tham gia vào trong nghiên cứu không được xác định có bất cứ bất thường nào khi sử dụng hai phương pháp xét nghiệm là MLPA và giải trình tự gen. Phương pháp MLPA và giải trình tự được sử dụng trong nghiên cứu này không thể phát hiện được những biến đổi nhỏ trong vùng điều hoà mà nằm cách xa gen PAX6 như SIMO hoặc EE. Hơn nữa, một số bất thường di truyền trên các gen khác như TRIM44, FOXC1,
PITX2 cũng đã được chứng minh gây ra bệnh khuyết mống mắt [45, 66, 67].
Do đó, chúng tôi sẽ tiến hành các nghiên cứu sâu hơn trên nhóm mẫu chưa phát hiện đột biến gây bệnh trong nghiên cứu này bằng các công nghệ cho phép phát hiện đột biến gen có quy mô lớn hơn như giải trình tự hệ gen biểu hiện (WES) hoặc aCGH. Hiện nay WES được sử dụng khá phổ biến trong xét nghiệm di truyền các bệnh hiếm gặp hoặc khi nhà nghiên cứu chưa định hình được rõ nhóm bệnh mà bệnh nhân đang gặp phải. Bằng cách sử dụng WES đã có nhiều đột biến trên vùng biểu hiện của các gen khác nhau đã được xác định trên các bệnh nhân mắc dị tật bẩm sinh. Bên cạnh đó, aCGH là phương pháp hữu hiệu cho xác định các vi mất đoạn trên toàn bộ hệ gen. Nhiều đột biến vi mất đoạn không thể xác định bởi nhiễm sắc thể đồ, MLPA đã được phát hiện nhờ kỹ thuật aCGH.
Lợi ích của aCGH trong nghiên cứu về tật khuyết mống mắt đã được chỉ ra trong nhiều nghiên cứu khác nhau. Thực vậy, năm 2016 Ansari và cộng sự đã sử dụng aCGH có độ phân giải cao để tìm đột biến di truyền trên 42 trường hợp bệnh nhân âm tính với giải trình tự nội gen PAX6. Kết quả tác giả đã tìm được 15 trên 42 trường hợp có các biến đổi cấu trúc nhỏ trong vùng 11p13 [45]. Một số bệnh nhân trong 27 trường hợp còn lại đã được chỉ ra mức hội chứng Gillespie do có đột biến trên gen ITPR1. Do đó, một số tác giả ước tính có khoảng 5% số trường hợp khuyết mống mắt sẽ không phát hiện được nguyên nhân [68]. Do vậy, để xác định được nguyên nhân di truyền của những bệnh nhân còn lại, aCGH với độ phân giải cao hoặc tập trung vào đột biến các gen khác sẽ là lựa chọn ưu tiên.
57
KẾT LUẬN
Từ những kết quả đạt được trong nghiên cứu này tôi xin đưa ra một số kết luận như sau:
- Đã ứng dụng thành công kỹ thuật MLPA và giải trình tự gen để phát hiện đột biến di truyền gây tật khuyết mống mắt trên người Việt Nam. - Đã xác định được đột biến gây bệnh ở 9/14 bệnh nhân khuyết mống
mắt. Trong đó, hai đột biến mất đoạn gen lớn và đột biến điểm trong gen PAX6.
- Kết quả của nghiên cứu bổ xung thông tin vào cơ sở dữ liệu đột biến gen gây bệnh mắt trong cộng đồng người Việt Nam.
58
KIẾN NGHỊ
Từ kết quả đáng khích lệ thu được bởi nghiên cứu này tôi mạnh dạn đưa ra những kiến nghị sau:
- Áp dụng phương pháp MLPA và giải trình tự Sanger để sàng lọc đột biến gen PAX6 cho bệnh nhân khuyết mống mắt.
- Đối với bệnh nhân không có đột biến gen PAX6, tiếp tục sàng lọc mở rộng bằng các phương pháp khác như phân tích aCGH, giải trình tự toàn bộ hệ gen mã hóa (WES) hoặc giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS).
59