Các loài nấm Trichoderma sp. được nghiên cứu có khả năng sản xuất các enzyme như protease làm bất hoạt các enzyme thủy phân được sản xuất từ các loài vi sinh vật gây bệnh (Kumar et al., 2007). Nhiều nghiên cứu đã tìm thấy
gen sản xuất protease từ dòng nấm Trichoderma harzianum được biến đổi. Nghiên cứu này đã nâng cao khả năng quản lý sinh học của các loài vi sinh vật có ích trong đất trong sản xuất các enzyme protease, chitinase, glucanase và các enzyme sinh tổng hợp phá hủy vách tế bào của loài vi sinh vật gây bệnh (Howell, 2003). Ngoài các dòng nấm Trichoderma sp. dòng vi khuẩn
Pseudomonas sp. cũng được nghiên cứu có khả năng sản xuất enzyme chitinase vài trò đặc hiệu trong nhân tố đối kháng với nấm gây bệnh (Fogliano
et al., 2002; Kumar et al., 2007). Sự hiệp lực của hai loài vi sinh vật có ích này đã nâng cao khả năng sản xuất enzyme chitinase trong đối kháng với vi sinh vật gây bệnh. Vai trò của Trichoderma harzianum còn được biết cho sản xuất enzyme proteinase trong đối kháng nấm gây bệnh và tuyến trùng hại rễ trong đất (Sharon et al., 2001).
Một nghiên cứu khác chứng minh các dòng nấm Trichoderma sp. có khả năng phát triển tốt ngay trong hệ thống vùng rễ cây trồng để nâng cao tính tự bảo vệ của cây trồng đối với vi sinh vật gây bệnh vùng rễ thông qua kích hoạt sản xuất các enzyme peroxidase, chitinase, β, 1-3 glucanase, chống lại bệnh thối rễ trên cây có múi do nấm Phytophthora sp. (Kumar et al., 2007; Sahai and Manocha, 1993) và nấm Fusarium sp. (El-Mohamedy and Ahmed, 2009; El–Mohamedy et al., 2012) gây ra. Đặc biệt, sử dụng các dòng vi sinh vật đối kháng qua việc bổ sung phân hữu cơ vinh vào trong đất đã góp phần giảm mật số vi sinh vật gây hại tại vùng rễ cây cam và nâng cao tính tự bảo vệ của cây trồng (Allay and Chakraborty, 2013; Elham et al., 2010; Jambhulkar et al., 2015).
Mỗi loài nấm khác nhau thể hiện khả năng sản xuất enzyme protease, chitinase, peroxidase khác nhau thông qua thể hiện khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh khác nhau. Đối với loài nấm gây bệnh Phytophthora citrophthora và Fusarium solani ở cây có múi thì dòng nấm Trichoderma harzianum được đánh giá có khả năng ức chế loài gây bệnh cao nhất (84%) so với các dòng nấm Trichoderma sp. khác (Jagtap et al., 2012). Trong khi dòng nấm Trichoderma virens có khả năng ức chế nấm Fusarium solani thấp nhất (68%) so với các dòng nấm Trichoderma sp. khác (Akrami et al., 2013).
2.6.2 Vi sinh vật trong tiết hormon thúc đẩy sự sinh trưởng cây trồng
Chất kích thích sinh trưởng đã được phát hiện ở nhiều nơi trong đất có nguồn gốc được sản xuất từ nhiều loài vi sinh vật đất, đặc biệt là trong đất giàu chất hữu cơ (Khan, 2021; Souza et al., 2015). Mặc dù dòng nấm Trichoderma virens có khả năng ức chế nấm gây bệnh thấp hơn so với các dòng nấm
Trichoderma sp. khác, tuy nhiên đáng chú ý là khả năng sản xuất chất kích thích sinh trưởng đóng vai trò quan trọng thúc đẩy sự phát triển cây trồng (Contreras-Cornejo et al., 2009). Sự tích lũy các auxin do dòng nấm
khối vùng rễ thông qua tăng chiều dài và kích thước rễ cây trồng, từ đó tăng cường khả năng hấp thu dưỡng chất trong đất (Borai et al., 2003; Harman et al., 2004; Navarro et al., 2006; Ozbay and Newman, 2004). Bên cạnh các dòng nấm hữu ích cho sản xuất chất kích thích sinh trưởng, thì một số dòng vi khuẩn có khả năng sản xuất IAA ở vùng rễ trong đất, tạo điều kiện thúc đẩy sự sinh trưởng của cây trồng (Mohite, 2013). Nâng cao mật số dòng vi khuẩn
Bacillus subtilis trong đất đã tăng cường sự sinh trưởng của cây trồng thông qua hoạt động sản xuất IAA tại vùng rễ trong đất (Swain et al., 2007).
Chất kích thích sinh trưởng IAA đã có vai trò thúc đẩy sự phát triển rễ cây trồng, đồng thời nâng cao sự tác động giữa cây trồng và hệ vi sinh vật trong đất (Brandl and Lindow, 1998; Pattan and Glick, 2002). Việc xác định và ứng dụng các dòng vi sinh vật có vai trò đối kháng bệnh và thúc đẩy sự phát triển cây có múi đã góp phần cân bằng hệ sinh thái trong đất canh tác trồng cây có múi, góp phần duy trì độ phì nhiêu đất và sức khỏe cây trồng (Trivedi et al., 2011). Bên cạnh đó, sử dụng kết hợp các dòng vi sinh vật có ích với nhau đã góp phần nâng cao quản lý sinh học trong bệnh hại. Sử dụng dòng nấm Trichoderma aureoviride kết hợp với các loài nấm rễ cộng sinh với cây trồng (Glomus intraradices) đã nâng cao sự sinh trưởng cây có múi hơn là chỉ sử dụng đơn lẻ dòng nấm Glomus intraradices trong đất (Whipps, 2001).
2.6.3 Vi sinh vật trong cạnh tranh dinh dưỡng
Một trong những cơ chế hoạt động trong quản lý sinh học bệnh hại là việc canh tranh dinh dưỡng của các loài vi sinh vật với nhau trong đất (Kumar
et al., 2007). Trong môi trường giàu chất hữu cơ thì N là yếu tố giới hạn cho sự phát triển của các vi sinh vật có ích. Việc bổ sung các dưỡng chất phù hợp đã giúp nâng cao hoạt động của vi sinh vật có ích trong hoạt động quản lý sinh học. Nhiều bệnh hại trên cây có múi được kiểm soát nhờ vào sử dụng các dòng vi sinh vật có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng với vi sinh vật gây bệnh (Janisiewicz et al., 2000; Liu et al., 2013). Nấm cộng sinh ở vùng rễ có khả năng giảm mật số nấm gây bệnh thối rễ trên cây có múi do Phytophthora sp. gây ra, đồng thời nâng cao sự sinh trưởng của cây trồng cũng như công tác quản lý sinh học bệnh hại trong đất (Wu et al., 2008; Watanarojanaporn et al., 2011). Vai trò của enzyme kết tủa ion Fe (sideropores) được sản xuất từ một số dòng vi sinh vật như Trichoderma sp. Đồng thời, các vi sinh vật này có khả hấp thụ các ion sắt bị kết tủa, dẫn đến cạnh tranh nguồn sắt trong đất đối với các vi sinh vật khác. Loài nấm Trichoderma virens có khả năng sản xuất ba loại siderophores: a moonohydroxymate; a dipeptide of trans-fusarinine; a trimer disdespipeptide có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng đối với vi sinh vật gây bệnh trong đất (Lorito et al., 1993).
Ngoài nấm Trichoderma sp. thì vi khuẩn flourescent pseudomanoas
(siderophore) có tính ái lực rất cao với sắt, từ đó cạnh tranh nguồn sắt trong môi trường để cạnh tranh dinh dưỡng với các vi sinh vật khác (Lo, 1998). Ion sắt đóng vai trò chính yếu trong tiến trình sinh hóa của vi sinh vật (Konhauser
et al., 2011). Trong điều kiện bị oxy hóa, ion sắt sẽ giới hạn dưỡng chất cho sự phát triển của vi sinh vật. Các vi sinh vật sẽ bị ức chế phát triển bởi nguồn sắt thiếu hụt từ sự kết ion sắt bởi các chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp gọi là siderophore. Siderophore này sẽ cố định các ion sắt III. Quá trình sinh tổng hợp siderophore này được quản lý chặt chẽ bởi nồng độ sắt trong đất. Khi nồng độ sắt III hòa tan trong đất ở mức thấp dẫn đến siderophore được sản xuất tích cực bởi sự tồn tại của các khoáng chứa ion sắt II. Như vậy, bên cạnh nồng độ sắt có trong đất thì dạng sắt tồn tại trong đất cũng có ý nghĩa rất quan trọng cho việc sản xuất siderophore bởi vi sinh vật (Konhauser et al., 2011). Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí và pH trung tính thì sắt II dễ dàng bị oxy hóa bởi thành sắt III.
10Fe2+ +1/2O2 +2H+ = 2Fe3+ +H2O
Vì vậy, điều kiện phù hợp cho các vi sinh vật hoạt động tiết enzyme kết tủa ion sắt thường trong điều kiện đất axit, sẽ tồn tại các vi sinh vật gọi là vi sinh vật ưa axit (acidophiles) như Acidothiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum ferrooxidans. Trong điều kiện nồng độ oxy thấp dưới 1,0 mg/l và pH trung tính thì ưu thế cho các vi sinh vật hiếu khí như Gallionella ferruginea thực hiện oxy hóa sắt II thành sắt III. Trong điều kiện yếm khí, sắt II cũng bị oxy hóa thành sắt III với sự có mặt của NO3- như chất nhận điện tử (Konhauser et al., 2011).
10Fe2+ + 2NO3- + 24H2O = 10Fe(OH)3 + N2 + 18H+
Sắt có vai trò quan trọng trong cấu tạo tế bào của vi sinh vật. Nồng độ sắt thấp trong đất dẫn đến ức chế quá trình sinh hóa tổng hợp tế bào của vi sinh vật (Symeonidis and Marango, 2012). Hầu hết các loài nấm gây bệnh, sắt giữ vai trò thiết yếu trong quá trình biến dưỡng. Nhu cầu sắt của các loài nấm gây bệnh cần lượng sắt từ 10-7 - 10-6 M Fe cho sự phát triển. Các loài nấm thường hấp thu sắt ở dạng sắt II theo một cơ chế đặc biệt từ quá trình khử sắt III thành sắt II. Trong khi đó, siderophore có chức năng cố định các ion sắt III dẫn đến hạn chế ion sắt II hình thành, làm thiếu hụt nguồn sắt trong quá trình phát triển của vi sinh vật (Symeonidis and Marango, 2012).
2.6.4 Vi sinh vật trong ký sinh vi sinh vật khác
Vi sinh vật ký sinh được xem là phương pháp tiềm năng quản lý sinh học bệnh hại trong đất (Kumar et al., 2007). Một trong số đó loài nấm có khả năng ký sinh có ích là nấm Trichoderma harzinium ký sinh trên tuyến trùng của con cái, làm giảm mật số tuyến trùng trong đất và trong rễ vùng trồng cây có múi. Một số loài vi sinh vật khác có khả năng ký sinh vào vùng rễ để ức chế vi sinh vật gây bệnh ký sinh trong vùng rễ. Loài nấm Tylechulus semi penetrans là vi
sinh vật ký sinh trên rễ cây có múi, có khả năng giới hạn sự phát triển của nấm
Phytophthora nicotianae và Fusarium solani tại vùng rễ cây (Borai et al., 2003). Hoạt động của những vi sinh vật ký sinh các loài gây bệnh trong đất tiết ra các enzyme: chitinase, cellulose, glucanase và các enzyme lytic khác. Các enzyme này có vai trò phá hủy cấu trúc tế bào của loài gây bệnh, tiêu hủy chất dinh dưỡng của tế bào hay tiết chất kháng sinh, chất độc đối với loài gây bệnh (Sharma et al., 2013). Các nhóm vi sinh vật ký sinh tiết chitosan có vai trò trong phá hủy sinh học, tiêu diệt các nhóm vi sinh vật gây thối rễ như
Fusarium sp. trong đất (Pal and McSpadden Gardener, 2006).
Các vi sinh vật ký sinh loài gây bệnh trong cơ chế quản lý sinh học được miêu tả qua bốn giai đoạn: Giai đoạn 1, vi sinh vật oxy hóa các chất hữu cơ và vô cơ tạo năng lượng cho vi sinh vật phát triển. Sau đó, các vi sinh vật ký sinh này sản xuất một số chất kích ứng hóa học về phía loài gây bệnh và phát hiện các vi sinh vật gây bệnh thông qua cơ chế tác động giữa một loại protein đặc biệt (lectin) của loài gây bệnh với thụ thể của loài ký sinh. Giai đoạn 3: vi sinh vật trong tác nhân quản lý sinh học ký sinh lên vi sinh vật gây bệnh và bắt đầu phá hủy vách tế bào bởi enzyme như chitinase, cellulose, β, 1-3 glucanase. Cuối cùng vi sinh vật ký sinh sẽ xâm nhập vào vi sinh vật gây bệnh từ đó làm giảm mật số và sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh trong đất (Kumar et al., 2007; Lo, 1998). Một số nghiên cứu đã chứng minh khi thể đột biến của vi sinh vật Serratia marcescens quản lý sinh học mất khả năng sản xuất một loại enzyme Chitin A đã dẫn đến giảm khả năng ức chế nấm gây bệnh Fusarium
sp. Tuy nhiên, khi chủng enzyme Chitin A này vào vi khuẩn Escherichia coli
để chủng lên cây đậu bị bệnh do nấm Sclerotium rolfsii gây ra dẫn đến giảm tỷ lệ bệnh trên cây đậu này.
2.6.5 Vi sinh vật trong vai trò tiết chất kháng sinh
Không giống như các loài vi sinh vật có khả năng ký sinh, cạnh tranh dinh dưỡng hay tiết enzyme phân hủy vách tế bào, chất kháng sinh có khả năng ức chế bệnh hại thực vật được sản xuất từ một số vi sinh vật nhất định (Lo, 1998). Các chất kháng sinh này tác động trực tiếp đến vi sinh vật gây bệnh. Cơ chế của các chất kháng sinh tác động lên loài gây bệnh rất phức tạp (Kumar et al., 2007). Nhiều chất kháng sinh có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh như glitoxin, gliovirin và glioviridin được sản xuất từ nấm
Trichoderma virens có vai trò trong ức chế rất tốt nấm gây bệnh bởi nấm
Pythium ultimum, Phytophthora sp. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi thể đột biến của nấm Trichoderma virens thiếu sản xuất glitoxin dẫn đến không có khả năng ức chế vi khuẩn Rasltonia solani, Verticillium dahliae,
Phymatotrichum omnivorum.
Một chất kháng sinh khác được biết đến vai trò ức chế cả nấm và vi khuẩn là peptabiols. Peptabiols có chiều dài từ 7-18 amino acid với một số
peptabiol khác nhau được sản xuất từ dòng nấm Trichoderma sp. như:
trichozianins, trichorzins, trichorozins, harzianins, trichogin…Các peptabiol này giới hạn các enzyme liên kết với màng tế bào dẫn đến ức chế tổng hợp vách tế bào, đồng thời phá hủy vách tế bào của VSV gây bệnh. Chi tiết các peptabiol đã ức chế tổng hợp β- glucans của vách tế bào (Kumar et al., 2007).
Một số chất kháng sinh được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus subtilis có vai trò ức chế nấm Fusarium sp. gây bệnh héo tươi trên cây trồng. Kháng sinh Bulbiformin được trích ra từ vi khuẩn Bacillus subtilis đã giảm mật số nấm
Fusarium sp. trong đất, đồng thời giảm 88% bệnh héo tươi trên cây trồng (Kumar et al., 2007). Nhiều chất chất kháng sinh được sản xuất từ vi khuẩn và các chất kháng sinh được phân loại dựa trên cấu trúc và chức năng của vi khuẩn ảnh hưởng đến vi sinh vật gây bệnh như phá hủy sinh tổng hợp vách tế bào, ức chế chức năng hoạt động của ribosome và sinh tổng hợp nucleic acid hoặc giới hạn chức năng của màng tế bào. Một số nghiên cứu cho thấy vai trò của các chất kháng sinh khác nhau như penicillin trong ức chế tổng hợp vách tế bào, kháng sinh metronidazole ức chế tổng hợp DNA, tetracyline và cloramphenicol ức chế sinh tổng hợp protein (Byarugaba, 2009).
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đề tài nghiên cứu được thực hiện qua sáu nội dung chính nhằm đánh giá hiện trạng canh tác, độ bạc màu đất và xác định tác nhân gây bệnh vàng lá thối rễ (VLTR) trên vườn cam Sành, làm cơ sở cho nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các dòng nấm có khả năng phân hủy chất hữu cơ và đối kháng nấm gây bệnh giúp cải thiện độ phì nhiêu đất, giảm bệnh VLTR và tăng năng suất trái vườn cam Sành.
Nội dung 1 được thực hiện qua điều tra phỏng vấn nông hộ và đánh giá đặc tính đất liếp vườn trồng cam Sành tại huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long nhằm đánh giá hiện trạng canh tác, nắm rõ những khó khăn gây ảnh hưởng đến sinh trưởng và năng suất trái vườn cam Sành.
Trên cơ sở xác định các nguyên nhân gây trở ngại trong canh tác cam Sành, đặc biệt là mức độ gây hại của bệnh VLTR, nội dung nghiên cứu 2 được thực hiện để xác định tác nhân gây bệnh vàng lá thối rễ trên vườn cam Sành.
Từ các kết quả nghiên cứu, đánh giá ở nội dung 1 và 2, nội dung nghiên cứu 3 xác định mục tiêu cần sản xuất phân hữu cơ vi sinh (HCVS) có khả năng cải thiện độ phì nhiêu đất và kiểm soát được bệnh vàng lá thối rễ trên vườn cam Sành. Để đạt mục tiêu đó, việc nghiên cứu nấm tăng nhanh khả năng phân hủy chất hữu cơ và nấm Trichoderma sp. từ vùng rễ cây cam Sành đến ức chế nấm gây bệnh VLTR được thực hiện. Kết quả nghiên cứu đã chọn được nấm có khả năng phân hủy tốt rơm rạ sử dụng cho sản xuất phân hữu cơ là nấm Trichoderma bản địa có vai trò đối kháng nấm được xác định là tác nhân gây bệnh VLTR trên vườn cam Sành.
Từ sản phẩm phân HCVS được nghiên cứu, thực hiện bố trí thí nghiệm ngoài đồng nhằm đánh giá hiệu quả của phân hữu cơ vi sinh trong cải thiện độ phì nhiêu đất (nội dung 4), cải thiện bệnh VLTR (nội dung 5) và tăng năng suất trái vườn cam Sành (nội dung 6).
Các nội dung nghiên cứu được trình bày tại lược đồ nội dung nghiên cứu (Hình 3.1).
Đánh giá hiện trạng canh tác và tình hình bệnh VLTR vườn trồng cam
Đánh giá các đặc tính đất đến tỷ lệ bệnh VLTR vườn trồng cam
Phân lập nấm Fusarium solani gây