Vi sinh vật ký sinh được xem là phương pháp tiềm năng quản lý sinh học bệnh hại trong đất (Kumar et al., 2007). Một trong số đó loài nấm có khả năng ký sinh có ích là nấm Trichoderma harzinium ký sinh trên tuyến trùng của con cái, làm giảm mật số tuyến trùng trong đất và trong rễ vùng trồng cây có múi. Một số loài vi sinh vật khác có khả năng ký sinh vào vùng rễ để ức chế vi sinh vật gây bệnh ký sinh trong vùng rễ. Loài nấm Tylechulus semi penetrans là vi
sinh vật ký sinh trên rễ cây có múi, có khả năng giới hạn sự phát triển của nấm
Phytophthora nicotianae và Fusarium solani tại vùng rễ cây (Borai et al., 2003). Hoạt động của những vi sinh vật ký sinh các loài gây bệnh trong đất tiết ra các enzyme: chitinase, cellulose, glucanase và các enzyme lytic khác. Các enzyme này có vai trò phá hủy cấu trúc tế bào của loài gây bệnh, tiêu hủy chất dinh dưỡng của tế bào hay tiết chất kháng sinh, chất độc đối với loài gây bệnh (Sharma et al., 2013). Các nhóm vi sinh vật ký sinh tiết chitosan có vai trò trong phá hủy sinh học, tiêu diệt các nhóm vi sinh vật gây thối rễ như
Fusarium sp. trong đất (Pal and McSpadden Gardener, 2006).
Các vi sinh vật ký sinh loài gây bệnh trong cơ chế quản lý sinh học được miêu tả qua bốn giai đoạn: Giai đoạn 1, vi sinh vật oxy hóa các chất hữu cơ và vô cơ tạo năng lượng cho vi sinh vật phát triển. Sau đó, các vi sinh vật ký sinh này sản xuất một số chất kích ứng hóa học về phía loài gây bệnh và phát hiện các vi sinh vật gây bệnh thông qua cơ chế tác động giữa một loại protein đặc biệt (lectin) của loài gây bệnh với thụ thể của loài ký sinh. Giai đoạn 3: vi sinh vật trong tác nhân quản lý sinh học ký sinh lên vi sinh vật gây bệnh và bắt đầu phá hủy vách tế bào bởi enzyme như chitinase, cellulose, β, 1-3 glucanase. Cuối cùng vi sinh vật ký sinh sẽ xâm nhập vào vi sinh vật gây bệnh từ đó làm giảm mật số và sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh trong đất (Kumar et al., 2007; Lo, 1998). Một số nghiên cứu đã chứng minh khi thể đột biến của vi sinh vật Serratia marcescens quản lý sinh học mất khả năng sản xuất một loại enzyme Chitin A đã dẫn đến giảm khả năng ức chế nấm gây bệnh Fusarium
sp. Tuy nhiên, khi chủng enzyme Chitin A này vào vi khuẩn Escherichia coli
để chủng lên cây đậu bị bệnh do nấm Sclerotium rolfsii gây ra dẫn đến giảm tỷ lệ bệnh trên cây đậu này.
2.6.5 Vi sinh vật trong vai trò tiết chất kháng sinh
Không giống như các loài vi sinh vật có khả năng ký sinh, cạnh tranh dinh dưỡng hay tiết enzyme phân hủy vách tế bào, chất kháng sinh có khả năng ức chế bệnh hại thực vật được sản xuất từ một số vi sinh vật nhất định (Lo, 1998). Các chất kháng sinh này tác động trực tiếp đến vi sinh vật gây bệnh. Cơ chế của các chất kháng sinh tác động lên loài gây bệnh rất phức tạp (Kumar et al., 2007). Nhiều chất kháng sinh có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh như glitoxin, gliovirin và glioviridin được sản xuất từ nấm
Trichoderma virens có vai trò trong ức chế rất tốt nấm gây bệnh bởi nấm
Pythium ultimum, Phytophthora sp. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi thể đột biến của nấm Trichoderma virens thiếu sản xuất glitoxin dẫn đến không có khả năng ức chế vi khuẩn Rasltonia solani, Verticillium dahliae,
Phymatotrichum omnivorum.
Một chất kháng sinh khác được biết đến vai trò ức chế cả nấm và vi khuẩn là peptabiols. Peptabiols có chiều dài từ 7-18 amino acid với một số
peptabiol khác nhau được sản xuất từ dòng nấm Trichoderma sp. như:
trichozianins, trichorzins, trichorozins, harzianins, trichogin…Các peptabiol này giới hạn các enzyme liên kết với màng tế bào dẫn đến ức chế tổng hợp vách tế bào, đồng thời phá hủy vách tế bào của VSV gây bệnh. Chi tiết các peptabiol đã ức chế tổng hợp β- glucans của vách tế bào (Kumar et al., 2007).
Một số chất kháng sinh được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus subtilis có vai trò ức chế nấm Fusarium sp. gây bệnh héo tươi trên cây trồng. Kháng sinh Bulbiformin được trích ra từ vi khuẩn Bacillus subtilis đã giảm mật số nấm
Fusarium sp. trong đất, đồng thời giảm 88% bệnh héo tươi trên cây trồng (Kumar et al., 2007). Nhiều chất chất kháng sinh được sản xuất từ vi khuẩn và các chất kháng sinh được phân loại dựa trên cấu trúc và chức năng của vi khuẩn ảnh hưởng đến vi sinh vật gây bệnh như phá hủy sinh tổng hợp vách tế bào, ức chế chức năng hoạt động của ribosome và sinh tổng hợp nucleic acid hoặc giới hạn chức năng của màng tế bào. Một số nghiên cứu cho thấy vai trò của các chất kháng sinh khác nhau như penicillin trong ức chế tổng hợp vách tế bào, kháng sinh metronidazole ức chế tổng hợp DNA, tetracyline và cloramphenicol ức chế sinh tổng hợp protein (Byarugaba, 2009).
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đề tài nghiên cứu được thực hiện qua sáu nội dung chính nhằm đánh giá hiện trạng canh tác, độ bạc màu đất và xác định tác nhân gây bệnh vàng lá thối rễ (VLTR) trên vườn cam Sành, làm cơ sở cho nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các dòng nấm có khả năng phân hủy chất hữu cơ và đối kháng nấm gây bệnh giúp cải thiện độ phì nhiêu đất, giảm bệnh VLTR và tăng năng suất trái vườn cam Sành.
Nội dung 1 được thực hiện qua điều tra phỏng vấn nông hộ và đánh giá đặc tính đất liếp vườn trồng cam Sành tại huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long nhằm đánh giá hiện trạng canh tác, nắm rõ những khó khăn gây ảnh hưởng đến sinh trưởng và năng suất trái vườn cam Sành.
Trên cơ sở xác định các nguyên nhân gây trở ngại trong canh tác cam Sành, đặc biệt là mức độ gây hại của bệnh VLTR, nội dung nghiên cứu 2 được thực hiện để xác định tác nhân gây bệnh vàng lá thối rễ trên vườn cam Sành.
Từ các kết quả nghiên cứu, đánh giá ở nội dung 1 và 2, nội dung nghiên cứu 3 xác định mục tiêu cần sản xuất phân hữu cơ vi sinh (HCVS) có khả năng cải thiện độ phì nhiêu đất và kiểm soát được bệnh vàng lá thối rễ trên vườn cam Sành. Để đạt mục tiêu đó, việc nghiên cứu nấm tăng nhanh khả năng phân hủy chất hữu cơ và nấm Trichoderma sp. từ vùng rễ cây cam Sành đến ức chế nấm gây bệnh VLTR được thực hiện. Kết quả nghiên cứu đã chọn được nấm có khả năng phân hủy tốt rơm rạ sử dụng cho sản xuất phân hữu cơ là nấm Trichoderma bản địa có vai trò đối kháng nấm được xác định là tác nhân gây bệnh VLTR trên vườn cam Sành.
Từ sản phẩm phân HCVS được nghiên cứu, thực hiện bố trí thí nghiệm ngoài đồng nhằm đánh giá hiệu quả của phân hữu cơ vi sinh trong cải thiện độ phì nhiêu đất (nội dung 4), cải thiện bệnh VLTR (nội dung 5) và tăng năng suất trái vườn cam Sành (nội dung 6).
Các nội dung nghiên cứu được trình bày tại lược đồ nội dung nghiên cứu (Hình 3.1).
Đánh giá hiện trạng canh tác và tình hình bệnh VLTR vườn trồng cam
Đánh giá các đặc tính đất đến tỷ lệ bệnh VLTR vườn trồng cam
Phân lập nấm Fusarium solani gây bệnh vàng lá thối rễ trên vườn cam sành (xác định tác nhân gây bệnh) Khảo sát khả năng gây bệnh của nấm Fusarium solani trong điều kiện nhà lưới
Nội dung 1: Đánh giá hiện trạng canh tác và đặc tính đất liếp vườn
trồng cam
Nội dung 2: Xác định tác nhân gây bệnh VLTR trên vườn cam
sành
Nội dung 3: Nghiên cứu sản xuất phân HCVS
Nội dung 4: Hiệu quả của phân HCVS trong cải thiện độ phì nhiêu
đất vườn trồng cam sành
Nội dung 5: Hiệu quả của phân HCVS trong cải thiện bệnh VLTR
trên vườn cam sành
Nội dung 6: Hiệu quả của phân HCVS trong cải thiện năng suất
trái vườn cam sành
1/ Độ phì nhiêu đất vườn trồng cam
2/ Vườn cam sành với tỷ lệ VLTR cao
3/ Năng suất trái vườn cam sành giảm thấp
Phân lập nấm Trichoderma sp. từ vùng rễ cây cam
Phân lập và tuyển chọn dòng nấm tăng khả năng phân hủy chất hữu cơ
Tuyển chọn dòng nấm được phân lập đối kháng nấm bệnh
LƯỢC ĐỒ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.1 Đánh giá hiện trạng canh tác vườn cam Sành tại Tam Bình, Vĩnh Long
Mục tiêu của nghiên cứu nhằm đánh giá hiện trạng canh tác và tình hình bệnh vàng lá thối rễ trên vườn cam Sành, cơ sở cho các nội dung nghiên cứu tiếp theo, đáp ứng mục tiêu nghiên cứu của đề tài.
3.1.1 Phương tiện nghiên cứu
- Nghiên cứu được thực hiện trên các vườn cam Sành thuộc hai xã có diện tích trồng cam Sành lớn nhất của huyện Tam Bình - Vĩnh Long: xã Tường Lộc (ấp Tường Lễ, ấp Tường Nhơn A) và xã Mỹ Thạnh Trung (ấp Mỹ Phú 4). Thời gian thực hiện từ tháng 11/2014 đến tháng 3/2015.
- Các vườn cam Sành có độ tuổi từ 1 năm tuổi được chọn thực hiện phỏng vấn.
- Phiếu khảo sát thu thập thông tin hiện trạng canh tác được trình bày ở Phụ lục 1.
3.1.2 Phương pháp nghiên cứu
Điều tra hiện trạng kỹ thuật canh tác qua phỏng vấn trực tiếp nông dân theo phiếu đã được in sẵn kết hợp khảo sát thực tế các vườn cam Sành có diện tích 0,1 ha trở lên. Tổng số 75 nông hộ được phỏng vấn bao gồm thông tin nông hộ, giống cây trồng, mật độ cây trồng, kỹ thuật thiết kế vườn, tuổi liếp vườn, tuổi cây, sử dụng phân bón (phân hữu cơ, vô cơ), tình hình bệnh VLTR, năng suất trái. Tỷ lệ bệnh VLTR được đánh giá theo phân loại cấp độ bệnh của Jones (1998) theo ba nhóm : C0-1: số cây bệnh/vườn chiếm 0 - 5%; C2-3: số cây bệnh/vườn 6 - 50%; C4-5: số cây bệnh/vườn từ 51% trở lên.
- Tổng hợp, phân tích, đánh giá số liệu thu thập qua phỏng vấn để xác định các trở ngại trong sản xuất cam Sành.
- Xử lý số liệu: Các số liệu sau khi thu thập được tổng hợp thực hiện thống kê mô tả.
3.2 Đánh giá một số đặc tính đất liếp vườn trồng cam Sành tại huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long
- Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 11/2014 đến tháng 5/2015.
- Vườn trồng cam của 16 nông hộ canh tác cam Sành thuộc 75 vườn khảo sát được chia thành hai nhóm tuổi liếp khác nhau: nhóm vườn có tuổi liếp thấp từ 15 năm tuổi trở xuống và nhóm vườn trên 15 năm tuổi.
- Vườn cam được chọn cho thu thập mẫu đất có diện tích 0,1 ha trở lên, tuổi cây từ 3 năm tuổi trở lên.
3.2.1 Phương pháp thu mẫu đất
Tổng số 16 mẫu đất của 16 vườn cam theo hai nhóm tuổi liếp khác nhau được thu thập ở độ sâu 0 - 20 cm, mẫu đất được thu tại vị trí mỗi cây, bên dưới tán cây, nơi bộ rễ phát triển nhiều nhất, mỗi gốc cây thu bốn mẫu đất, trộn thành một mẫu. Mẫu đất sau khi được thu, phơi khô trong điều kiện phòng thí nghiệm, nghiền qua rây 2 mm và 0,5 mm cho phân tích một số đặc tính đất như pH, CHC, Nhd, Phd, Ktđ, phần trăm base bảo hòa.
3.2.2 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được phân tích thống kê ANOVA qua sử dụng phần mềm MiniTab 16.1. So sánh trung bình các nghiệm thức qua kiểm định Tukey và sử dụng kiểm định T-test trung bình hai mẫu để so sánh hai giá trị trung bình.
3.3 Đánh giá một số đặc tính đất liên quan đến bệnh vàng lá thối rễ trên vườn cam Sành vườn cam Sành
Mục tiêu của nghiên cứu nhằm đánh giá một số đặc tính đất đối với mức độ bệnh VLTR trên vườn cam Sành.
- Vườn trồng cam của 40 nông hộ thuộc 75 vườn được khảo sát, được chia thành hai nhóm vườn (vườn không bệnh VLTR và vườn bệnh VLTR) cho thực hiện cho nội dung nghiên cứu đánh giá một số đặc tính đất liên quan đến bệnh VLTR.
3.3.1Phương pháp thu mẫu đất
- Thu thập 40 mẫu đất theo hai nhóm có bệnh và không bệnh VLTR được thu thập ở độ sâu tầng đất từ 0 - 20 cm, mẫu đất được thu thập tại vị trí mỗi cây, bên dưới tán cây, nơi bộ rễ phát triển nhiều nhất, mỗi gốc cây thu 4 mẫu đất, trộn thành một mẫu duy nhất. Đất thu thập được phân tích một số đặc tính vật lý đất (ẩm độ đất); đặc tính hóa học đất: pH đất, CHC; chỉ tiêu sinh học đất: mẫu đất được thu thập cho xác định mật số nấm Trichoderma sp.,
Fusarium sp. và tổng mật số vi sinh vật đất (bao gồm nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn).
- Đối với chỉ tiêu phân tích đặc tính vật lý và hóa học đất, mẫu đất phơi khô trong điều kiện phòng thí nghiệm. Sau đó, mẫu đất được nghiền qua rây 2 mm và 0,5 mm. Đối với chỉ tiêu sinh học đất, mẫu đất sau khi thu thập được đặt trong túi giấy đã vô trùng trước đó và tiến hành trữ mẫu ở nhiệt độ 4oC. Các chỉ tiêu phân tích được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Khoa học đất, Khoa Nông nghiệp.
3.3.2 Phương pháp phân tích đặc tính đất - Chỉ tiêu lý và hóa học đất - Chỉ tiêu lý và hóa học đất
- Ẩm độ đất: ẩm độ đất được tính theo ẩm độ khối lượng, mẫu được sấy ở 105oC đến trọng lượng không thay đổi.
- Giá trị pH đất được đo bằng pH kế với tỷ lệ đất: nước là (1:2,5).
- Chất hữu cơ được xác định theo phương pháp Walkley – Black (Nelson và Sommers, 1982).
- Đạm hữu dụng trong đất: Hàm lượng đạm NH4+ và NO3- có trong mẫu đất được ly trích bằng muối KCl 2M với tỷ lệ đất: dung dịch trích là 1:10 (w/v). Hàm lượng đạm hữu dụng sau khi ly trích được xác định theo phương pháp so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 650nm đối với đạm ammonium và 540 nm đối với nitrate (Rhine et al., 1998; Miranda et al., 2001).
- Lân hữu dụng trong đất được xác định theo phương pháp Bray 2. Dung dịch sau khi ly trích được so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 880nm (Bray và Kurtz, 1945).
- Kali trao đổi trong đất được ly trích bằng dung dịch BaCl2 0,1M không đệm (Hendershot et al., 1986; Rhoades, 1982). Dung dịch sau ly trích được đo trên máy hấp thu nguyên tử ở bước sóng 766nm.
- Các cation trao đổi trong đất và CEC được ly trích bằng BaCl2 0,1M và chuẩn độ với EDTA 0,01M và được đo trên máy hấp thu nguyên tử (Kariuki et al., 2010) cho tính phần trăm base bảo hòa trong đất.
- Chỉ tiêu sinh học đất
Mật số vi sinh vật trong đất được xác định bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc sống trên môi trường nuôi cấy, kết hợp xem hình dạng, bào tử nấm dưới kính hiển vi để xác định loài nấm. Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) được dùng để xác định tổng mật số vi sinh vật trong đất (Gupta et al., 2010; El-Mohamedy et al., 2012). Môi trường PDA và TSM có bổ sung kháng khuẩn (cloramphenicol 0,025%) để đếm mật số nấm Fusarium
sp. (Gupta et al., 2010; El-Mohamedy et al., 2012) và nấm Trichoderma sp. (Elad et al., 1981) lần lượt. Các môi trường thực hiện thí nghiệm được điều chỉnh pH đến 5,5. Mẫu đất được trích bằng dung dịch Sodium pyrophosphat 0,2% (w/v) (Junghanns et al., 2008), vô trùng với tỉ lệ 1:10, pha loãng dung dịch trích từ 10-1 đến 10-5 và hút 100 µL dung dịch pha loãng chà lên đĩa môi trường đã được chuẩn bị trước đó và được nuôi cấy ở nhiệt độ phòng cho xác định tổng mật số vi sinh vật, mật số nấm Fusarium sp. và Trichoderma sp. trong đất.
3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu sau khi phân tích được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel để tổng hợp số liệu. Phân tích phương sai ANOVA qua sử dụng phần mềm thống kê MiniTab 16.1. So sánh trung bình các nghiệm thức qua kiểm định Tukey và sử dụng kiểm định T-test trung bình hai mẫu để so sánh hai giá trị trung bình.
3.4 Xác định tác nhân gây bệnh vàng lá thối rễ trên cây cam Sành trong
điều kiện nhà lưới
3.4.1 Phân lập nấm Fusarium solani gây bệnh vàng lá thối rễ trên cây cam