kiện nhà lưới
Thí nghiệm được thực hiện trong nhà lưới và phòng thí nghiệm Vi sinh của Bộ môn Khoa học Đất, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ, trong thời gian từ tháng 11/2015 đến tháng 5/2016.
a) Phương tiện nghiên cứu
- Cây cam giống: được mua từ trại giống tại huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long. Cây giống được chọn sinh trưởng khỏe mạnh, không có triệu chứng bệnh, đồng nhất về độ tuổi, chiều cao và số lá (chiều cao 30 cm, mọc từ 10 lá thật trở lên).
- Giá thể trồng cam: được phối trộn từ đất thịt pha cát, phân hữu cơ và mụn dừa với tỷ lệ 3 đất : 1 phân hữu cơ : 1 mụn dừa, tỷ lệ được xác định theo thành phần khối lượng. Thực hiện vô trùng giá thể ở nhiệt độ 121oC trong 30 phút với 2 lần cách nhau 7 ngày.
- Nguồn nấm: Mười ba dòng nấm Fusarium solani được phân lập trên môi trường WA 2% ở trên và được nuôi cấy trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng cho đến khi tạo bào tử. Thực hiện pha huyền phù bào tử bằng cách cho 20 mL nước cất thanh trùng vào các đĩa petri chứa nấm, dùng một miếng lame sạch cạo nhẹ trên bề mặt môi trường, sau đó huyền phù được lọc lại bằng 3 lớp vải mỏng vô trùng để loại bỏ sợi nấm. Rút 200 µL huyền phù bào tử, đếm mật
số dưới kính hiển vi bằng lam đếm hồng cầu. Từ đó xác định lượng nước cần pha loãng để có huyền phù bào tử với mật số cần sử dụng (5 x 106 bào tử/mL) (Dương Minh vàctv., 2010).
b) Phương pháp nghiên cứu - Thực hiện chủng nấm gây bệnh:
+ Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 5 lần lặp lại, 13 nghiệm thức bao gồm 12 chủng nấm đã phân lập và một nghiệm thức đối chứng không chủng nấm, chỉ xử lý bằng nước cất vô trùng, mỗi lặp lại là 1 cây cam trồng trong một chậu giá thể có đường kính đáy l2 cm.
+ Thực hiện chủng nấm gây bệnh: Sau khi cây đã phát triển khỏe mạnh trong bầu giá thể, tiến hành tưới vào gốc cam huyền phù nấm chứa 5 x 106 bào tử/mL. Sau 30 ngày chủng bệnh, tiến hành đánh giá chỉ số bệnh, tỷ lệ cây chết do bệnh và cấp bệnh (Dương Minh, 2010).
- Thu thập và phân lập lại nấm Fusarium sp. Thu thập và phân lập lại sự hiện diện của nấm Fusarium sp. ở 13 nghiệm thức đã bố trí thí nghiệm ở giai đoạn 60 ngày sau khi chủng (NSKC).
+ Khảo sát mật số nấm Fusarium sp. sau khi bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm đánh giá mật số nấm Fusarium sp. được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh Bộ môn Khoa học đất. Sau khi hoàn thành thí nghiệm đánh giá tỷ lệ bệnh trên cây cam của mỗi nghiệm thức ở giai đoạn 60 ngày NSKC, tiến hành xác định lại mật số nấm Fusarium sp. trong giá thể trên mỗi nghiệm thức. Các mẫu giá thể được xác định ẩm độ trước khi phân tích, từ đó làm cơ sở để xác định mật số nấm Fusarium sp. trên 1 gram giá thể khô. Quy trình được thực hiện như sau: Cân 1 gram giá thể tươi có ẩm độ xác định cho vào ống falcon 50 mL, sau đó thêm vào 20 mL dung dịch phosphate buffer gồm 31,5 gram NaHPO4.2H2O và 27,3 gram Na2PO4.12 H2O pha trong 1000 mL nước cất. Mỗi mẫu đất được thực hiện với 2 lần lặp lại. Mẫu được lắc trên máy lắc ngang với tốc độ 130 vòng/phút trong 1 giờ. Hút 1 mL dung dịch cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9 mL nước cất vô trùng, pha loãng dãy dung dịch với hệ số hòa loãng 10. Hút 50 µL dung dịch huyền phù vi sinh vật trong dãy nồng độ pha loãng và được trải đều trên bề mặt môi trường PDA (đã bổ sung kháng khuẩn Streptomycin 0,5%) bằng que chà thủy tinh. Sau đó mẫu được đặt trong tủ ủ ở nhiệt độ 30oC trong 2 ngày. Tiến hành đếm số khuẩn lạc sống của nấm hiện diện trên đĩa petri và tính toán kết quả số liệu.
c) Các chỉ tiêu nghiên cứu
- Tính chỉ số bệnh và tỷ lệ cây chết do bệnh và cấp bệnh theo công thức:
Trong đó: n1, n2, n3, n4, n5 lần lượt là số lá bị bệnh cấp 1,2,3,4,5
N: tổng số lá có cấp bệnh C: cấp bệnh quy ước cao nhất
Cấp bệnh theo thang Carling et al. (1999) gồm có 5 cấp bệnh Cấp 0: không có lá bệnh Cấp 1: 1 đến 10% lá bệnh Cấp 2: Trên 10% đến 20% lá bị bệnh Cấp 3: Trên 20% đến 60% lá bị bệnh Cấp 4: Trên 60% đến 80% lá bị bệnh Cấp 5: Trên 80% lá bị bệnh
- Mật số khuẩn lạc của nấm Fusarium sp. gây bệnh trong giá thể trồng cam.