Điều tra hiện trạng kỹ thuật canh tác qua phỏng vấn trực tiếp nông dân theo phiếu đã được in sẵn kết hợp khảo sát thực tế các vườn cam Sành có diện tích 0,1 ha trở lên. Tổng số 75 nông hộ được phỏng vấn bao gồm thông tin nông hộ, giống cây trồng, mật độ cây trồng, kỹ thuật thiết kế vườn, tuổi liếp vườn, tuổi cây, sử dụng phân bón (phân hữu cơ, vô cơ), tình hình bệnh VLTR, năng suất trái. Tỷ lệ bệnh VLTR được đánh giá theo phân loại cấp độ bệnh của Jones (1998) theo ba nhóm : C0-1: số cây bệnh/vườn chiếm 0 - 5%; C2-3: số cây bệnh/vườn 6 - 50%; C4-5: số cây bệnh/vườn từ 51% trở lên.
- Tổng hợp, phân tích, đánh giá số liệu thu thập qua phỏng vấn để xác định các trở ngại trong sản xuất cam Sành.
- Xử lý số liệu: Các số liệu sau khi thu thập được tổng hợp thực hiện thống kê mô tả.
3.2 Đánh giá một số đặc tính đất liếp vườn trồng cam Sành tại huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long
- Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 11/2014 đến tháng 5/2015.
- Vườn trồng cam của 16 nông hộ canh tác cam Sành thuộc 75 vườn khảo sát được chia thành hai nhóm tuổi liếp khác nhau: nhóm vườn có tuổi liếp thấp từ 15 năm tuổi trở xuống và nhóm vườn trên 15 năm tuổi.
- Vườn cam được chọn cho thu thập mẫu đất có diện tích 0,1 ha trở lên, tuổi cây từ 3 năm tuổi trở lên.
3.2.1 Phương pháp thu mẫu đất
Tổng số 16 mẫu đất của 16 vườn cam theo hai nhóm tuổi liếp khác nhau được thu thập ở độ sâu 0 - 20 cm, mẫu đất được thu tại vị trí mỗi cây, bên dưới tán cây, nơi bộ rễ phát triển nhiều nhất, mỗi gốc cây thu bốn mẫu đất, trộn thành một mẫu. Mẫu đất sau khi được thu, phơi khô trong điều kiện phòng thí nghiệm, nghiền qua rây 2 mm và 0,5 mm cho phân tích một số đặc tính đất như pH, CHC, Nhd, Phd, Ktđ, phần trăm base bảo hòa.
3.2.2 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được phân tích thống kê ANOVA qua sử dụng phần mềm MiniTab 16.1. So sánh trung bình các nghiệm thức qua kiểm định Tukey và sử dụng kiểm định T-test trung bình hai mẫu để so sánh hai giá trị trung bình.
3.3 Đánh giá một số đặc tính đất liên quan đến bệnh vàng lá thối rễ trên vườn cam Sành vườn cam Sành
Mục tiêu của nghiên cứu nhằm đánh giá một số đặc tính đất đối với mức độ bệnh VLTR trên vườn cam Sành.
- Vườn trồng cam của 40 nông hộ thuộc 75 vườn được khảo sát, được chia thành hai nhóm vườn (vườn không bệnh VLTR và vườn bệnh VLTR) cho thực hiện cho nội dung nghiên cứu đánh giá một số đặc tính đất liên quan đến bệnh VLTR.
3.3.1Phương pháp thu mẫu đất
- Thu thập 40 mẫu đất theo hai nhóm có bệnh và không bệnh VLTR được thu thập ở độ sâu tầng đất từ 0 - 20 cm, mẫu đất được thu thập tại vị trí mỗi cây, bên dưới tán cây, nơi bộ rễ phát triển nhiều nhất, mỗi gốc cây thu 4 mẫu đất, trộn thành một mẫu duy nhất. Đất thu thập được phân tích một số đặc tính vật lý đất (ẩm độ đất); đặc tính hóa học đất: pH đất, CHC; chỉ tiêu sinh học đất: mẫu đất được thu thập cho xác định mật số nấm Trichoderma sp.,
Fusarium sp. và tổng mật số vi sinh vật đất (bao gồm nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn).
- Đối với chỉ tiêu phân tích đặc tính vật lý và hóa học đất, mẫu đất phơi khô trong điều kiện phòng thí nghiệm. Sau đó, mẫu đất được nghiền qua rây 2 mm và 0,5 mm. Đối với chỉ tiêu sinh học đất, mẫu đất sau khi thu thập được đặt trong túi giấy đã vô trùng trước đó và tiến hành trữ mẫu ở nhiệt độ 4oC. Các chỉ tiêu phân tích được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Khoa học đất, Khoa Nông nghiệp.
3.3.2 Phương pháp phân tích đặc tính đất - Chỉ tiêu lý và hóa học đất - Chỉ tiêu lý và hóa học đất
- Ẩm độ đất: ẩm độ đất được tính theo ẩm độ khối lượng, mẫu được sấy ở 105oC đến trọng lượng không thay đổi.
- Giá trị pH đất được đo bằng pH kế với tỷ lệ đất: nước là (1:2,5).
- Chất hữu cơ được xác định theo phương pháp Walkley – Black (Nelson và Sommers, 1982).
- Đạm hữu dụng trong đất: Hàm lượng đạm NH4+ và NO3- có trong mẫu đất được ly trích bằng muối KCl 2M với tỷ lệ đất: dung dịch trích là 1:10 (w/v). Hàm lượng đạm hữu dụng sau khi ly trích được xác định theo phương pháp so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 650nm đối với đạm ammonium và 540 nm đối với nitrate (Rhine et al., 1998; Miranda et al., 2001).
- Lân hữu dụng trong đất được xác định theo phương pháp Bray 2. Dung dịch sau khi ly trích được so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 880nm (Bray và Kurtz, 1945).
- Kali trao đổi trong đất được ly trích bằng dung dịch BaCl2 0,1M không đệm (Hendershot et al., 1986; Rhoades, 1982). Dung dịch sau ly trích được đo trên máy hấp thu nguyên tử ở bước sóng 766nm.
- Các cation trao đổi trong đất và CEC được ly trích bằng BaCl2 0,1M và chuẩn độ với EDTA 0,01M và được đo trên máy hấp thu nguyên tử (Kariuki et al., 2010) cho tính phần trăm base bảo hòa trong đất.
- Chỉ tiêu sinh học đất
Mật số vi sinh vật trong đất được xác định bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc sống trên môi trường nuôi cấy, kết hợp xem hình dạng, bào tử nấm dưới kính hiển vi để xác định loài nấm. Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) được dùng để xác định tổng mật số vi sinh vật trong đất (Gupta et al., 2010; El-Mohamedy et al., 2012). Môi trường PDA và TSM có bổ sung kháng khuẩn (cloramphenicol 0,025%) để đếm mật số nấm Fusarium
sp. (Gupta et al., 2010; El-Mohamedy et al., 2012) và nấm Trichoderma sp. (Elad et al., 1981) lần lượt. Các môi trường thực hiện thí nghiệm được điều chỉnh pH đến 5,5. Mẫu đất được trích bằng dung dịch Sodium pyrophosphat 0,2% (w/v) (Junghanns et al., 2008), vô trùng với tỉ lệ 1:10, pha loãng dung dịch trích từ 10-1 đến 10-5 và hút 100 µL dung dịch pha loãng chà lên đĩa môi trường đã được chuẩn bị trước đó và được nuôi cấy ở nhiệt độ phòng cho xác định tổng mật số vi sinh vật, mật số nấm Fusarium sp. và Trichoderma sp. trong đất.
3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu sau khi phân tích được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel để tổng hợp số liệu. Phân tích phương sai ANOVA qua sử dụng phần mềm thống kê MiniTab 16.1. So sánh trung bình các nghiệm thức qua kiểm định Tukey và sử dụng kiểm định T-test trung bình hai mẫu để so sánh hai giá trị trung bình.
3.4 Xác định tác nhân gây bệnh vàng lá thối rễ trên cây cam Sành trong
điều kiện nhà lưới
3.4.1 Phân lập nấm Fusarium solani gây bệnh vàng lá thối rễ trên cây cam
Sành
a) Phương tiện nghiên cứu
+ Chọn cây cam Sành tại các vườn trồng cam ở huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long có triệu chứng điển hình trên lá và rễ được ghi nhận thông tin và thu thập các mẫu rễ.
+ Môi trường WA 2% (Water Agar) cho phân lập nấm Fusarium solani
(Burgess et al., 2008). Môi trường WA 2% được điều chỉnh pH đến 5,5. + Môi trường PDA thực hiện tách ròng và lưu trữ nấm Fusarium solani. + Chất kháng khuẩn Streptomycin 0,5% bổ sung vào môi trường cho phân lập nấm.
+ Thực hiện tại Khu thực nghiệm, Phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất - Bộ môn Khoa học đất, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ
b) Phương pháp nghiên cứu
- Mẫu rễ sau khi thu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh-Bộ môn Khoa học đất gồm các bước sau:
+ Rửa mẫu rễ cam Sành đã chọn dưới vòi nước máy để loại bỏ bụi bẩn + Chọn mẫu rễ có phần ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe
+ Khử trùng bề mặt mẫu rễ cam bằng cồn ethyl 70% trong thời gian 1 phút
+ Làm khô bề mặt mẫu rễ cam bằng giấy vô trùng
+ Dùng kéo tiệt trùng cắt mẫu rễ thành những mảnh nhỏ ở vị trí ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe
+ Dùng kẹp tiệt trùng chuyển những mẫu rễ vừa cắt đặt lên môi trường WA 2% có bổ sung kháng khuẩn (streptomycin 0,5%), mỗi mẫu thực hiện 3 lần lặp lại trên đĩa petri với 8 mẫu rễ/đĩa. Sau đó, đặt các mẫu đã cấy vào tủ ủ và ủ ở nhiệt độ 300C cho nuôi cấy.
+ Sau 24 giờ nuôi cấy, khi sợi nấm đã phát triển trên môi trường WA 2%, tiến hành đục khuẩn ty nấm thành từng khoanh tròn (d= 5 mm) ở gần rìa của tản nấm và cấy vào đĩa petri có chứa môi trường PDA đã bổ sung kháng
khuẩn streptomycin 0,5% thực hiện tiến hành tách ròng cho đến khi được dòng thuần.
- Khảo sát đặc điểm hình thái, màu sắc nấm và kích thước bào tử
xác định nấm Fusarium solani: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức tương ứng với 1 chủng nấm Fusarium solani được phân lập từ 1 mẫu rễ và thực hiện 2 lần lặp lại trong điều kiện phòng thí nghiệm. Các chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA ở điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm (28-30oC) trong 48 giờ cho sợi nấm phát triển sau đó tiến hành quan sát và mô tả hình thái, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc nấm. Thí nghiệm khảo sát hình thái, đặc điểm bào tử được thực hiện theo phương pháp slide culture để xác định nấm Fusarium solani (Liyanapathirana and Wijiedasa, 2012)
c) Các chỉ tiêu ghi nhận
- Sự thay đổi về màu sắc, hình dạng của tản nấm trên môi trường PDA - Đường kính tản nấm ở các thời điểm 2 và 5 ngày sau khi cấy.
- Hình dạng, màu sắc, kích thước bào tử ở thời điểm 2 ngày sau khi cấy bằng phương pháp slide culture.
- Thời gian hình thành bào tử trên môi trường nuôi cấy
3.4.2 Khảo sát khả năng gây bệnh của nấm Fusarium solani trong điều
kiện nhà lưới
Thí nghiệm được thực hiện trong nhà lưới và phòng thí nghiệm Vi sinh của Bộ môn Khoa học Đất, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ, trong thời gian từ tháng 11/2015 đến tháng 5/2016.
a) Phương tiện nghiên cứu
- Cây cam giống: được mua từ trại giống tại huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long. Cây giống được chọn sinh trưởng khỏe mạnh, không có triệu chứng bệnh, đồng nhất về độ tuổi, chiều cao và số lá (chiều cao 30 cm, mọc từ 10 lá thật trở lên).
- Giá thể trồng cam: được phối trộn từ đất thịt pha cát, phân hữu cơ và mụn dừa với tỷ lệ 3 đất : 1 phân hữu cơ : 1 mụn dừa, tỷ lệ được xác định theo thành phần khối lượng. Thực hiện vô trùng giá thể ở nhiệt độ 121oC trong 30 phút với 2 lần cách nhau 7 ngày.
- Nguồn nấm: Mười ba dòng nấm Fusarium solani được phân lập trên môi trường WA 2% ở trên và được nuôi cấy trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng cho đến khi tạo bào tử. Thực hiện pha huyền phù bào tử bằng cách cho 20 mL nước cất thanh trùng vào các đĩa petri chứa nấm, dùng một miếng lame sạch cạo nhẹ trên bề mặt môi trường, sau đó huyền phù được lọc lại bằng 3 lớp vải mỏng vô trùng để loại bỏ sợi nấm. Rút 200 µL huyền phù bào tử, đếm mật
số dưới kính hiển vi bằng lam đếm hồng cầu. Từ đó xác định lượng nước cần pha loãng để có huyền phù bào tử với mật số cần sử dụng (5 x 106 bào tử/mL) (Dương Minh vàctv., 2010).
b) Phương pháp nghiên cứu - Thực hiện chủng nấm gây bệnh:
+ Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 5 lần lặp lại, 13 nghiệm thức bao gồm 12 chủng nấm đã phân lập và một nghiệm thức đối chứng không chủng nấm, chỉ xử lý bằng nước cất vô trùng, mỗi lặp lại là 1 cây cam trồng trong một chậu giá thể có đường kính đáy l2 cm.
+ Thực hiện chủng nấm gây bệnh: Sau khi cây đã phát triển khỏe mạnh trong bầu giá thể, tiến hành tưới vào gốc cam huyền phù nấm chứa 5 x 106 bào tử/mL. Sau 30 ngày chủng bệnh, tiến hành đánh giá chỉ số bệnh, tỷ lệ cây chết do bệnh và cấp bệnh (Dương Minh, 2010).
- Thu thập và phân lập lại nấm Fusarium sp. Thu thập và phân lập lại sự hiện diện của nấm Fusarium sp. ở 13 nghiệm thức đã bố trí thí nghiệm ở giai đoạn 60 ngày sau khi chủng (NSKC).
+ Khảo sát mật số nấm Fusarium sp. sau khi bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm đánh giá mật số nấm Fusarium sp. được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh Bộ môn Khoa học đất. Sau khi hoàn thành thí nghiệm đánh giá tỷ lệ bệnh trên cây cam của mỗi nghiệm thức ở giai đoạn 60 ngày NSKC, tiến hành xác định lại mật số nấm Fusarium sp. trong giá thể trên mỗi nghiệm thức. Các mẫu giá thể được xác định ẩm độ trước khi phân tích, từ đó làm cơ sở để xác định mật số nấm Fusarium sp. trên 1 gram giá thể khô. Quy trình được thực hiện như sau: Cân 1 gram giá thể tươi có ẩm độ xác định cho vào ống falcon 50 mL, sau đó thêm vào 20 mL dung dịch phosphate buffer gồm 31,5 gram NaHPO4.2H2O và 27,3 gram Na2PO4.12 H2O pha trong 1000 mL nước cất. Mỗi mẫu đất được thực hiện với 2 lần lặp lại. Mẫu được lắc trên máy lắc ngang với tốc độ 130 vòng/phút trong 1 giờ. Hút 1 mL dung dịch cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9 mL nước cất vô trùng, pha loãng dãy dung dịch với hệ số hòa loãng 10. Hút 50 µL dung dịch huyền phù vi sinh vật trong dãy nồng độ pha loãng và được trải đều trên bề mặt môi trường PDA (đã bổ sung kháng khuẩn Streptomycin 0,5%) bằng que chà thủy tinh. Sau đó mẫu được đặt trong tủ ủ ở nhiệt độ 30oC trong 2 ngày. Tiến hành đếm số khuẩn lạc sống của nấm hiện diện trên đĩa petri và tính toán kết quả số liệu.
c) Các chỉ tiêu nghiên cứu
- Tính chỉ số bệnh và tỷ lệ cây chết do bệnh và cấp bệnh theo công thức:
Trong đó: n1, n2, n3, n4, n5 lần lượt là số lá bị bệnh cấp 1,2,3,4,5
N: tổng số lá có cấp bệnh C: cấp bệnh quy ước cao nhất
Cấp bệnh theo thang Carling et al. (1999) gồm có 5 cấp bệnh Cấp 0: không có lá bệnh Cấp 1: 1 đến 10% lá bệnh Cấp 2: Trên 10% đến 20% lá bị bệnh Cấp 3: Trên 20% đến 60% lá bị bệnh Cấp 4: Trên 60% đến 80% lá bị bệnh Cấp 5: Trên 80% lá bị bệnh
- Mật số khuẩn lạc của nấm Fusarium sp. gây bệnh trong giá thể trồng cam.
3.5 Phân lập và tuyển chọn các dòng nấm có khả năng phân hủy chất hữu
cơ và đối kháng nấm gây bệnh Fusarium solani
3.5.1 Phân lập và tuyển chọn các dòng nấm từ vùng đất trồng lúa đến tăng nhanh khả năng phân hủy chất hữu cơ tăng nhanh khả năng phân hủy chất hữu cơ
- Địa điểm: Tại Trung tâm nghiên cứu Vi sinh Môi trường, Bonn, CHLB Đức
- Thời gian: Từ tháng 4/2015 đến tháng 9/2015
a) Thông tin về các dòng nấm được phân lập
- Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu Vi sinh Môi trường, Bonn trong năm 2015. Dòng nấm Rhizomucor variabilis và Gongronella butleri được phân lập và tuyển chọn từ mẫu đất trồng lúa ở huyện Thạnh Phú, tỉnh Bến Tre. Nấm Rhizomucor variabilis và
Gongronella butleri được đánh giá tăng nhanh khả năng phân hủy chất hữu cơ tốt nhất trong số 35 dòng nấm được phân lập và dã được kiểm tra an toàn sinh học tại Trung tâm Nghiên cứu Vi sinh Môi trường (UFZ) (Bảng 3.1). Trong đó, dòng nấm Gongronella butleri có khả năng phân hủy chất hữu cơ khá cao (41,7%) ở 14 ngày được nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Bên cạnh khả năng phân hủy chất hữu cơ, dòng nấm Gongronella