chất BVTV đến cá medaka ở mức độ sinh học phân tử
RT-PCR là kỹ thuật thực hiện phản ứng chuỗi polymerase định lượng (RT- PCR) để khuếch đại trình tự nucleotide ngắn từ một lượng nhỏ của các mô và có thể tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản của một trình tự ADN đặc hiệu. Kỹ thuật RT- PCR có thể xác định biểu hiện kiểu gen khác nhau của các động vật thủy sinh ở mức độ gen thông thường nên ngày càng được sử dụng rộng rãi trong việc giám sát môi trường ô nhiễm.
Kết quả ảnh hưởng của hóa chất BVTV DDT lên hệ gen của cá medaka trong luận án này được kiểm tra bằng phương pháp phân tích RT-PCR (LightCycler® 96 System- Roche Life Science). Mẫu sau khi phơi nhiễm với DDT lần lượt được thực hiện: phân tách RNA, tổng hợp cDNA, và phân tích RT-PCR. Qui trình cụ thể được thực hiện như Hình 2.8 dưới đây:
Hình 2. 8. Quy trình tóm tắt chuẩn bị mẫu và phân tích Real-time PCR
Trình tự mã hóa của 4 gen lựa chọn được lấy từ cơ sở dữ liệu GenBank (PubMed-NCBI) và HGNC (Ensembl, EMBL–EBI). Trình tự của mỗi cặp mồi mã hóa được trình bày theo công bố của Barjhoux và cộng sự [89]. Đối với mỗi gen, các cặp mồi cụ thể được xác định bằng phần mềm LightCycler probe design software
(v1.0, Roche, Meylan,France) và được đề cập trong Bảng 2.6. Phân tích biểu hiện gen được thực hiện trên các mẫu phôi và cá medaka trưởng thành theo quy trình thời gian và nhiệt độ (Bảng 2.7).
Bảng 2. 6. Các cặp mồi phân tích Real-time PCR
Cặp mồi
Mã số cập (EMBL
hoặc GenBank) Trình tự (5’ – 3’) Chức năng
β-actin S74868 GTGACCCACACAGTGCCa Gen đối chứng
GCGACGTAGCACAGCTTCb
p53 AF212997 TCTGGCACTGCAAAGTCTGTa Điều hòa chu kỳ
CCTCGTTTTGGTGGTGGGb tế bào
GCATCATCAAGACGGTGGAGa Điều hòa sự tăng
rarα1 EF546452 trưởng và biệt
GGCGAAAGCGAAAACCAGGb hóa của tế bào
wnt AJ243208 CCGCTTTGACGGAGCATa Tăng sinh tế bào
TTGAACCCACGCCCACAGCb và sinh sản
a: mồi xuôi b: mồi ngược
Bảng 2. 7. Cài đặt quy trình phân tích phản ứng Real-time PCR
Thứ tự Số chu kỳ lập lại Nhiệt độ (o
C) Thời gian (phút) Bước 1 1X 95 5 94 0,5 Bước 2 40X 50 0,5 72 0,5 Bước 3 1X 72 5 Bước 4 81X 65–95 0,5
Để có kết quả chính xác về độc tính của DDT đối với cá medaka, phân tích RT- PCR xác định những thay đổi về mức độ sinh học phân tử của gen cá trước và sau khi phơi nhiễm với DDT đã được khảo sát. Phôi và cá medeka trưởng thành được phơi nhiễm với hóa chất BVTV DDT ở nồng độ 1500 và 1700 g/L trong vòng 24
giờ mà không cho ăn. Sau khi phơi nhiễm, phôi cá và cá trưởng thành sẽ được giữ trong -80oC cho đến khi phân tích RT-PCR.