Đánh giá ảnh hưởng của hóa chất BVTV nói chung và hóa chất DDTs nói riêng trong môi trường sinh thái thủy sinh thì ngoài đối tượng nhuyễn thể là những loài ăn lọc và sống ở tầng đáy, việc xem xét ảnh hưởng của DDTs đến những loài sinh vật lớn hơn sống ở tầng giữa và tầng mặt cũng hết sức cần thiết. Trong phạm vi nghiên cứu của luận án này, tôi chọn cá medaka (Oryzias latipes) hay còn được gọi là cá gạo Nhật Bản làm đối tượng nghiên cứu do có nhiều đặc điểm sinh học ưu việt.
3.4.2.1. Đánh giá độc tính của DDTs đến sinh trưởng và phát triển phôi cá medaka O. latipes
10 phôi cá medaka O. latipes (24 giờ tuổi) được lựa chọn ngẫu nhiên và cho phơi nhiễm với hóa chất BVTV DDTs ở 8 nồng độ khác nhau (0; 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,2; 0,24 và 0,28 µg/L) trong các đĩa 6 giếng SPL (Hàn Quốc). Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.28 và Hình 3.30. Độc tính của hóa chất BVTV ở các nồng độ khác nhau ảnh hưởng đến phôi cá medaka là khác nhau, nồng độ của DDTs càng cao thì tỷ lệ sống của phôi cá medaka càng giảm. Kết quả cho thấy, ở các mẫu có bổ sung hóa chất DDTs hầu hết các phôi cá medaka thử nghiệm đều có tỷ lệ sống thấp. Trong đó, nồng độ (0,28 g/L) thể hiện độc tính mạnh nhất với tỷ lệ tử vong là 100% chỉ sau 24 giờ phơi nhiễm. Ở các nồng độ còn lại, tỷ lệ tử vong thay đổi tương ứng từ 8,3-85%
(24 giờ); 18,3-96,7% (48 giờ); 30-100% (72 giờ) và tăng lên 43-100% (96 giờ) so với mẫu đối chứng có tỷ lệ sống sót đạt 100% ở cả bốn thời điểm phơi nhiễm.
Bảng 3. 28. Tỷ lệ tử vong của phôi cá medaka sau 24, 48, 72 và 96 giờ phơi nhiễm DDT
Nồng độ (µg/L) Số lượng phôi tử vong (%) 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ
0 0 0 0 0 0,04 8,3 18,3 30 43,3 0,08 23,3 35 46,7 56,7 0,12 36,7 48,3 61,7 75 0,16 51,7 61,7 73,3 83,3 0,2 65 78,3 90 100 0,24 85 96,7 100 100 0,28 100 100 100 100
100 80 (% ) 60 lệ tử v on g 40 T ỷ 20 0 120 100 vo ng ( % ) 80 60 lệ tử T ỷ 40 20 0 b b c c d d e e 0 0,04 0,08 0,12 0,16 0,2 Nồng độ (µg/L) a b b c d ee 0 0,04 0,08 0,12 0,16 0,2 Nồng độ (µg/L) a) 120 a 100 80 b c 60 c 40 d 20 d 0 e 0 0,04 0,08 0,12 0,16 0,24 120 Nồng độ (µg/L) c) a 100 b b 80 60 c d 40 20 0 e 0,24 0 0,04 0,08 0,12 0,16 Nồng độ (µg/L) b) a b 0,2 0,24 d) a a 0,2 0,24
Hình 3. 30. Biến động tỷ lệ tử vong của phôi cá medaka sau 24, 48, 72 và 96 giờ phơi nhiễm với 0; 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,2 và 0,24 μg/L hóa chất BVTV DDT
(a) 24 giờ; (b) 48 giờ; c) 72 giờ và d) 96 giờ (Nồng độ 0,28 μg/L tỷ lệ tử vong là 100% nên không so sánh và đánh giá sự khác biệt)
Kết quả của luận án đã chỉ ra ảnh hưởng của hóa chất BVTV trong môi trường nước đến sự phát triển của các loài động, thực vật và thủy sinh. Tỷ lệ tử vong của phôi cá tăng dần theo nồng độ hóa chất BVTV và theo thời gian phơi nhiễm. Điều này là do DDTs có khả năng tích lũy trong cơ thể người và động vật, nhất là các mô mỡ, mô sữa, đến khi đủ lượng gây độc thì DDTs sẽ gây ra các ảnh hưởng nghiêm trọng về mặt sinh học thậm chí làm chết sinh vật. DDTs có mặt trong môi trường đã làm xáo trộn điều kiện sống, gây stress cho cơ thể sinh vật. Bên cạnh đó, đặc tính sinh học của cá thử
nghiệm bao gồm kích thước, trọng lượng, tuổi, giới tính và chu kỳ vòng đời cũng ảnh hưởng đến khả năng gây độc tính [167].
3.3.2.2. Đánh giá độc tính LC50 số cá thể tại thời điểm phơi nhiễm DDTs
Kết quả đánh giá khả năng ảnh hưởng đến 50% tỷ lệ cá thể thử nghiệm khi phơi nhiễm với các nồng độ DDTs đến phôi cá medaka O. latipes thể hiện trong Bảng 3.29 và Hình 3.31, tỷ lệ tử vong của phôi cá tăng tuyến tính với nồng độ hóa chất BVTV DDTs và tăng khi thời gian phơi nhiễm kéo dài. Các giá trị LC50 sau 24, 48, 72 và 96 giờ được xác định bằng phương pháp nội suy trực tiếp Probit nhờ việc xác định sự tương quan giữa liều phản ứng và % tỷ lệ tử vong và nồng độ chất độc.
Bảng 3. 29. Giá trị LC50 của DDTs tại các thời điểm 24, 48, 72 và 96 giờ phơi nhiễm
Nồng độ DDT (μg/L ), ρ < 0,05
Tỷ lệ tử vong 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ
LC10 0,047 0,027 0,019 0,029 LC20 0,065 0,044 0,029 0,031 LC30 0,079 0,057 0,037 0,033 LC40 0,090 0,067 0,043 0,035 LC50 0,101 0,077 0,049 0,036 LC60 0,112 0,087 0,054 0,039 LC70 0,124 0,098 0,060 0,039 LC80 0,137 0,110 0,068 0,041 LC90 0,156 0,128 0,078 0,043 LC99 0,200 0,169 0,102 0,049
Tỷ lệ tử vong (%) Tỷ lệ tử vong (%) 100 a) 75 50 LC = 0,101 µg/L 50 25 Tỷ lệ tử vong Trung bình Cận trên Cận dưới 0 0.00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 Nồng độ (µg/L) 100 c) 75 50 LC50 = 0,049 µg/L 25 100 b) 75 vo ng ( % ) 50 LC = 0,077 µg/L Tỷ lệt ử 50 25 0 0.00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 Nồng độ (µg/L) 100 d) 75 vo ng ( % ) 50 LC = 0,036 µg/L T ỷ lệ tử 50 25 0 0 0.00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0.00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 Nồng độ (µg/L) Nồng độ (µg/L)
Hình 3. 31. Đồ thị tương quan giữa liều phản ứng và % tỷ lệ tử vong và nồng độ DDTs a) 24 giờ; b) 48 giờ; c) 72 giờ; d) 96 giờ
Trong nghiên cứu của luận án, các thí nghiệm đã được tiến hành để đánh giá độc tính cấp tính của DDTs đến sự sinh trưởng và phát triển của phôi medaka O. latipes. LC50 ở các loài khác nhau là khác nhau với cùng một loại hóa chất BVTV do cơ chế tác động khác nhau. Vì vậy, đường cong độc tính thường được vẽ để biểu hiện cơ chế tác động của hóa chất BVTV (Hình 3.31). Hình dạng của đường cong biểu thị bản chất cơ chế tác động hóa chất BVTV đó có khả năng tích lũy trong mô sinh học thường xuyên hay không thường xuyên [168]. Kết quả của nghiên cứu hiện tại tương tự với nghiên cứu độc tính về hóa chất BVTV đối với một số loài cá nước ngọt khác nhau [169].
Sự thay đổi này đã được chứng minh rằng khi kéo dài thời gian phơi nhiễm với DDTs thì DDTs sẽ xâm nhập vào cơ thể sẽ gây ảnh hưởng đến cột sống và thậm chỉ là tủy sống, làm vẹo xương sống của phôi cá, làm cá mất sức sống và chết [170]. DDTs cũng có khả năng chuyển hóa thành DDE thông qua việc loại bỏ hydro chloride. DDE ưa béo hơn DDTs và có khả năng tích tụ nhiều trong máu, mỡ của mô cá, gây độc ở gan, não, thận, mô - tuyến thượng thận, hệ thần kinh của cá [170]. Những chất độc này sẽ làm thay đổi các đặc tính sinh lý và điện sinh lý của màng tế bào thần kinh, xâm nhập vào gan và tạo thành các khối u. Khi nồng độ hấp thụ đạt ngưỡng sẽ làm cá tử vong, làm tổn thương não và hệ thần kinh - yếu tố quan trọng nhất làm phôi cá mất khả năng sinh sống.
3.4.2.3. Khảo sát hình thái phôi cá medaka
Độc tính của DDTs cũng được ghi nhận khi quan sát hình thái phôi cá medaka (Hình 3.33). Những phôi cá medaka phơi nhiễm với hóa chất BVTV DDTs bị biến dạng phần đầu và cổ (Hình 3.32a, 3.32c), đầu và mắt bị phù nề (Hình 3.32b, 3.32d), hai mắt quá gần nhau (Hình 3.32e) và cổ cong vẹo (Hình 3.32f) so với mẫu đối chứng (Hình 3.32g).
g
Hình 3. 32. Độc tính của DDTs đến phôi cá medaka O. latipes, những khiếm khuyết hình thái điển hình
Biến dạng phần đầu và cổ (a, c), đầu và mắt bị phù nề (b, d), hai mắt quá gần nhau (e) và cổ cong vẹo (f) so với mẫu đối chứng (g)
Khi DDTs xâm nhập vào trong phôi gây ra những tác động nhất định lên sự phát triển phôi. DDTs tác động đến hệ cơ và hệ tuần hoàn, làm tăng nhịp tim để tăng cường sự trao đổi chất và ảnh hưởng đến quá trình nở của phôi (làm phôi chậm hay không nở dẫn đến tăng dị tật và gây chết phôi) [168]. Trong các thủy vực, cá thường chết do ô
nhiễm nước từ hóa chất BVTV từ các cánh đồng canh tác liền kề và khi hóa chất BVTV chảy vào nguồn nước tiếp nhận sẽ gây tử vong các loài thủy sinh [171]. Các hóa chất BVTV nói chung và hóa chất OCPs nói riêng, các kim loại nặng, độc tố... có trong nước đều gây nguy hiểm với phôi, cá chưa trưởng thành và có thể làm giảm đáng kể số lượng quần thể, thậm chí gây tuyệt chủng toàn bộ số cá trong môi trường bị ô nhiễm. Một số nghiên cứu đã ghi nhận DDTs và các đồng phân của DDTs làm giảm sự tồn tại và tăng trưởng của phôi cá, gây nên sự bất thường về tập tính hoặc có thể tác động lên cấu trúc của cơ thể cá [172, 173].
3.4.2.4. Đánh giá độc tính của DDTs bằng phương pháp phân tích RT-PCR
DDTs là một chất độc tiếp xúc, làm tê liệt và ảnh hưởng đến hệ thần kinh, nhưng có sự khác biệt lớn về độ nhạy cảm của các loài cá khác nhau đối với hóa chất này. Cá là sinh vật có cơ chế điều hòa thẩm thấu ion khá tốt và do đó có thể giữ một thành phần tương đối ổn định của các ion vô cơ trong cơ thể của chúng, ngay cả khi điều kiện môi trường xung quanh thay đổi. Nhiều quá trình sinh lý như chức năng cơ và thần kinh rất nhạy cảm với sự thay đổi trong thành phần ion tương đối của chất trong cơ thể. Do đó, sự thẩm thấu ion bị xáo trộn có thể làm giảm nghiêm trọng khả năng của sinh vật nhằm duy trì các chức năng quan trọng để tồn tại trong tự nhiên.
Ngoài các yếu tố ảnh hưởng trên của DDTs, để đánh giá sâu hơn về mức độ phân tử, 4 gen với các cặp mồi xuôi và mồi ngược được chọn lọc (β-actin, p53, rarα1, wnt) để phân tích sự phiên mã bởi vì chúng đại diện cho sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào, quy định vòng đời và sự chết của tế bào [174].
Kết quả phân tích RT-PCR thể hiện trong các Hình 3.33, 3.34 và 3.35 dưới đây:
Hình 3. 33. Biểu hiện của 3 gen p53, rara1 và wnt trên phôi cá medaka sau khi phơi nhiễm với 1700 g/L DDTs bằng phương pháp Real-time PCR
Hình 3. 34. Biểu hiện của 3 gen p53, rara1 và wnt trên phôi cá medaka sau khi phơi nhiễm với 1500 và 1700 g/L DDTs bằng phương
pháp Real-time PCR
A
B
Hình 3. 35. Kết quả phân tích sự thành công của Real-time PCR và chu kỳ định lượng (Cq)
A) SYBR Green I (thuốc nhuộm liên kết DNA sợi đôi phổ biến), B) Bản đồ nhiệt cho các mẫu mà gen p53, rara1 và wnt được chỉ định
Các kết quả về định lượng mức độ biểu hiện gen (so sánh delta-Cq) được thu thập, và mức độ biểu hiện gen được chuẩn hóa đến gen đối chứng β-actin. Theo kết quả của Hình 3.33, 3.34 và 3.35 cho thấy, phân tích RT-PCR đã hoàn thiện. Sự biểu hiện của các gen cá medaka này sau khi phơi nhiễm với DDTs 1700 g/L trong 24 giờ đã được phân tích bằng phương pháp real-time PCR. So với mẫu đối chứng (Sự biểu hiện của gen là 1), sự biểu hiện của rara1 và wnt được gây ra mạnh mẽ sau khi tiếp xúc với với 1700 g/L DDTs trong 24 giờ (lần lượt là 4,9 và 5,4 lần). Sự biểu hiện của gen p53 có xu hướng bị ức chế sau khi tiếp xúc với DDTs ở phôi cá medaka (0,9 lần) (Hình 3.33). Kết quả này chứng minh rằng nồng độ 1700 g/L DDTs có thể ảnh hưởng đến sự phát triển, biệt hóa và tăng sinh của tế bào ở giai đoạn phôi của cá medaka. Ngoài ra, sự khác biệt về hình thành và phát triển của tế bào có thể gây rối loạn hình dạng, và điều kiện phát triển bình thường của cá medaka ở giai đoạn ấu trùng và trưởng thành. Do đó, sự theo dõi ảnh hưởng của DDTs ở các giai đoạn sau của phôi cá là cần thiết.
Để đánh giá liệu DDTs có ảnh hưởng đến các gen được phân tích ở giai đoạn phôi và giai đoạn trưởng thành, cá medaka trưởng thành được phơi nhiễm với 1500 và 1700 g/L DDTs trong 24 giờ. Kết quả phân tích ở Hình 3.34 cho thấy, sự biểu hiện của cả 3 gen p53, rara1 và wnt đều giảm theo nồng độ được phơi nhiễm. Kết quả này hoàn toàn trái ngược với giai đoạn phôi, sự biểu hiện cả hai gen rara1 và wnt đều giảm đáng kể ở các mẫu thử nghiệm phơi nhiễm với DDTs so với mẫu đối chứng không phơi nhiễm với DDTs. Cụ thể, đối với gen p53, sự biểu hiện của gen này ở cá medaka trưởng thành giảm lần lượt là 0,9 và 0,5 lần sau khi tiếp xúc với DDTs ở nồng độ 1500 và 1700 g/L so với mẫu đối chứng (1 lần). Tương tự, sự biểu hiện của gen rara1 ở cá medaka trưởng thành cũng giảm so với mẫu đối chứng sau khi tiếp xúc với DDTs ở nồng độ 1500 và 1700 g/L lần lượt là 0,36 và 0,09 lần. Đối với gen
wnt, sự biểu hiện của gen này cá medaka trưởng thành giảm lần lượt là 0,53 và 0,09 lần sau khi tiếp xúc với DDTs ở nồng độ 1500 và 1700 g/L. Điều này cho thấy sự ảnh hưởng của gen biểu hiện phụ thuộc vào các giai đoạn phát triển của tế bào cũng như liều lượng của hóa chất được điều trị [174]. Ngoài ra sự biệt hóa cũng như sự phát triển và tăng sinh của tế bào ở giai đoạn phôi và trưởng thành khác nhau cũng ảnh hưởng đến sự biểu hiện gen của tế bào [175].
Chọn thuốc nhuộm (SYBR Green I) cho thí nghiệm đơn sắc xác định kết hợp kênh cho phép đo trong quá trình phân tích. Giếng màu xanh lá cây thể hiện các mẫu được nhuộm thành công. Giếng màu đỏ thể hiện các mẫu nhuộm thất bại (Hình 3.35A). Bản đồ nhiệt cho thấy hình ảnh của đĩa nhiều giếng được sử dụng trong thí nghiệm cho kênh được chỉ định (Hình 3.35B). Đối với mỗi giếng, mỗi nhóm tính toán được hiển thị. Vì phân tích nóng chảy độ phân giải cao là đặc trưng cho gen đặc biệt, chỉ các mẫu gen liên quan được chỉ định mới được hiển thị. Trong phân tích định lượng tuyệt đối, nồng độ đã biết của từng tiêu chuẩn được tự động vẽ theo các giá trị Cq (chu trình định lượng) đo được. Tùy theo các gen khác nhau mà Cq có giá trị khác nhau theo bản đồ nhiệt, giá trị Cq từ 18,46 đến 36,31.
Theo nghiên cứu của Wu và cộng sự, trứng medaka đã thụ tinh được tiếp xúc với etanol (0-400 mM) trong 48 giờ sau khi thụ tinh và phân tích thành phần DNA, RNA và protein của phôi bằng phân tích real-time-PCR. Kết quả các mẫu RNA được phân tích thêm về bảy yếu tố phiên mã, emx2, en2, iro3, otx2, shh, wnt1 và zic5 được biểu hiện trong ống thần kinh của phôi medaka ở giai đoạn phát triển ban đầu [176]. Một nghiên cứu khác trên cá medaka Nhật Bản đã kết hợp hiệu suất định lượng của SYBR Green – real time – PCR với khả năng lập nhiều gen của một mảng nhỏ để kiểm tra tập hợp biểu hiện của 36 gen liên quan đến các con đường nội tiết trong não, gan và tuyến sinh dục [177]. Nhìn chung, các kết quả cho thấy RT – PCR có tiềm năng như một công cụ sàng lọc các hóa chất có khả năng gây rối loạn nội tiết và làm sáng tỏ cơ chế hoạt động.