- Dựa trên kết quả ở bảng 3.21, tính LD50 theo công thức của Karber (theo Nguyễn Xuân Phách, Nguyễn Thế Minh, 1995)[27]:
Z: số trung bình tử vong củ a2 nhóm kế cận d: khoảng cách liều lượng giữa các nhóm.
4.2.2. Kiểm định chất lượng của Kiểm định Quốc gia:
Kiểm định Quốc gia về HTKNR bao gồm hai nhóm kiểm định: nhóm kiểm định an toàn, công hiệu và nhóm kiểm định tính chất lý hóa (thử nghiệm xác định nồng độ NaCl, nồng độ protein, nồng độ chất bảo quản, pH...).
Thông thường, kiểm định Quốc gia làm công tác đánh giá chất lượng sau cùng, sau khi kiểm định cơ sở đã tiến hành xong cho kết quả đạt yêu cầu. Kiểm định Quốc gia được tiến hành theo yêu cầu của nhà sản xuất, thường là kiểm định các thành phẩm đã hoàn chỉnh. Đây là những thử nghiệm được thực hiện độc lập với cơ sở sản xuất, với các trang thiết bị hiện đại, động vật thí nghiệm đạt chuẩn, phòng thí nghiệm hoàn thiện nhất, cho thử nghiệm được tiến hành trong điều kiện tốt nhất, hóa chất chuẩn nhất, nhân viên lành nghề nhất.... Kiểm định Quốc gia có hệ thống các quy trình kỹ thuật riêng, tiêu chuẩn đánh giá riêng, tuân thủ gần như tuyệt đối theo các điều khoản quy định chặt chẽ có tính pháp lý của Dược điển Việt Nam. Việc lấy mẫu kiểm định là ngẫu nhiên, theo quy trình lấy mẫu riêng, cũng được quy định rất cụ thể, rõ ràng trong Dược điển Việt Nam.
Mỗi quốc gia có Dược điển của mình. Sản xuất HTKNR có thể tham khảo Dược điển các nước về tiêu chuẩn cho sản phẩm; cũng có thể tham khảo theo hướng dẫn của WHO, tuy nhiên cuối cùng vẫn phải tuyệt đối tuân thủ luật pháp trong sản xuất, sử dụng thuốc...theo các tiêu chuẩn quốc gia của Dược điển Việt Nam. Do đó, kết quả thử nghiệm của Viện kiểm định quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, Bộ y tế là quan trọng nhất trong kết luận về chất lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đề tài nghiên cứu sản xuất.
Kiểm định cấp I hay kiểm định sản xuất là khâu đầu tiên của kiểm tra chất lượng toàn diện. Kiểm định cơ sở hay kiểm định cấp II thực hiện đánh giá cơ bản qua bốn thử nghiệm an toàn, công hiệu là rất quan trọng. Tuy điều kiện cơ sở sản xuất chưa tốt, chúng tôi vẫn đánh giá cẩn thận theo tiêu chí chất lượng bốn kiểm định an toàn, công hiệu (bảng 3.18; 3.19; 3.20; 3.21). Sau khi
có kết quả của kiểm định quốc gia, đối chiếu với kết quả của chúng tôi, thấy hoàn toàn phù hợp: HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 nghiên cứu Đạt an toàn chung, không có chất gây sốt, vô khuẩn; chỉ khác một chút về kết quả đánh giá công hiệu: hiệu giá do chúng tôi xác định là 285,7 LD50/lọ; Kiểm định Quốc gia xác định là 267,5 LD50/lọ (thấp hơn 18 LD50/lọ 5 ml so với Kiểm định cơ sở). Theo Tiêu chuẩn Quốc gia, Dược điển Việt Nam III, IV, đều không quy định cụ thể về hiệu giá HTKNR là bao nhiêu, bởi đây là khâu khó xác định trước, do từng nhà sản xuất đặt mục tiêu. Hướng dẫn của WHO cũng tương tự, không có quy định cụ thể mức đạt về công hiệu (hiệu giá). Theo Dược điển Châu Âu (Eropean Pharmacopoeia 5.0) hiệu giá phải > 100 LD50 như vậy sản phẩm có hiệu giá gấp đôi yêu cầu [65].
Theo dõi thông tin sản phẩm HTKNR trên thế giới cho thấy: HTKN- RCN đa giá F(ab’)2 chống nọc hai loại RCN Bungarus candidus và Bungarus multicinctus, từ huyết tương ngựa của đề tài là sản phẩm thành công trong phòng thí nghiệm đầu tiên trên thế giới. Các hội nghị khoa học về HTKNR trên thế giới, gần nhất là Hội nghị độc chất học Châu Á –Thái Bình Dương tại Vladivostoc (Nga) tháng 11/2011 và Hội nghị chống độc châu Á lần thứ X (APAMT) tại Penang, Malaysia (2011) [89], thông tin trên các tạp chí Quốc tế, chưa có tác giả nào thông báo sản xuất sản phẩm tương tự.
Hiện nay, trong khu vực Đông nam Á, Thái Lan và Malaysia là hai nước phát triển nghiên cứu sản xuất HTKNR mạnh nhất. Về sản phẩm HTKN-RCN cho hai loài rắn cạp nia bắc và rắn cạp nia nam, các nước trên có nhiều nghiên cứu đáng chú ý. Theo Fung S.Y; Ponnudurai G., Tan N.H (2004) [135], những nhà khoa học hàng đầu của Malaysia về HTKNR - sản phẩm HTKN-RCN đa giá, trong phòng thí nghiệm (trên thỏ) cho loài rắn cạp nia B. flavicep của Malaixia có hiệu giá là 42 LD50/ml, 167 LD50/ml, có khả năng phản ứng chéo trung hòa nọc rắn cạp nia B. candidus, B. multicinctus. Trước đó, Chanhome
L., Wongtongkam N., Khow O. (1999) [51], sản xuất HTKN rắn cạp nong (B. fasciatus), cũng nhận thấy có nhiều sự tương đồng giữa nọc B. fasciatus với nọc B. candidus, B. multicinctus. Các tác giả trên đã nghiên cứu sản xuất HTKNR đa giá chống nọc rắn hổ mang Thái Lan, rắn hổ chúa và rắn cạp nong; sau đó thí nghiệm thử trung hòa nọc độc B. candidus, B. multicinctus
trên chuột nhưng đã không thành công. Các tác giả Ponnudurai G., Tan N.H
(1990) [134] cho rằng: có nhiều sự tương đồng về KN nọc giữa B. flavicef, B. fasciatus với B. candidus, B. multicinctus. Họ cho rằng có thể dùng HTKN- RCN B. flavicef của Malaysia, hay B. fasciatus của Thái Lan trung hòa nọc độc B. candidus, B. multicinctus. Tuy nhiên, điều này rất khó, khi nọc rắn có tính đặc hiệu địa phương và khi sản xuất HTKNR đa giá, tính đặc hiệu kháng nọc giảm đi so với HTKNR đơn giá chống một loại nọc rắn, hiệu quả khi điều trị sẽ thấp và phải dùng số lượng HTKNR nhiều hơn, hậu quả do protein miễn dịch khác loài cũng cao hơn. Mặt khác, với Việt Nam, hai loài rắn cạp nia B. fasciatus và B. flavicef có số lượng không nhiều, nhu cầu ít hơn nhiều so với Thái Lan và Malaysia. Trong khi đó, rắn cạp nia Việt Nam, Lào và
Campuchia có đặc điểm giống nhau. Chúng ta đang phát triển nghiên cứu về rắn cạp nia tốt hơn so với hai nước bạn Lào và Campuchia; tương lai khi chúng ta sản xuất được đại trà HTKN-RCN cho hai loại Bungarus candidus,
Bungarus multicinctus có thể sản xuất phục vụ các nhu cầu lớn hơn (xuất khẩu cho Lào, Campuchia, phục vụ cơ số chiến đấu cho Quân đội...).
Láng giềng Việt Nam khác là Đài Loan, Trung Quốc hiện nay đã sản xuất được HTKN-RCN bắc cho mình từ rất sớm. Theo Chippaux J.P, Goiffon M. (1998) [55], HTKNR bivalent neurotoxic của Đài Loan cho rắn hổ mang
Naja naja atra và Bungarus multicinctus có hiệu giá 1ml serum potency là 100 LD50, như vậy sản phẩm của chúng ta sản xuất có hiệu giá thấp hơn của Đài Loan, đây là thực tế, chúng ta cần nghiên cứu thêm về phương pháp của họ để
cải thiện hơn về hiệu giá.
Như vậy, sẽ còn phải chờ đợi thời gian khá lâu nữa để có sản phẩm HTKNR trên thị trường có thể nhập về điều trị, chưa kể giá cả có hợp lý hay không. Mặt khác, tính KN theo vùng địa lý của nọc rắn sẽ là một điều khó khăn cho ý tưởng mua HTKNR của nước khác, trừ việc họ sản xuất theo đơn đặt hàng của chúng ta. Cũng nên tính đến tính chủ động trong cung cấp thuốc. Về nhóm các tiêu chuẩn lý hóa: các thử nghiệm này chỉ được yêu cầu làm khi có một lô HTKNR cần xuất xưởng, ra thị trường hoặc sử dụng trong lâm sàng. Theo bảng 3.23, các tiêu chuẩn đều đạt: pH 7.012, NaCl 0,87%; nồng độ chất bảo quản Merthiolat = 0; nồng độ protein = 7,43 g/dl.(WHO<10 g/dl). lượng albumin còn rất ít (1,4g/l), chủ yếu là globulin (48,4 g/l) với 95,6% là mảnh F(ab’)2 cho thấy HTKN-RCN nghiên cứu đạt độ tinh sạch cao (bảng 3.17). Theo khuyến cáo của WHO, nồng độ merthiolate < 1/10.000, hoặc không nên sử dụng chất bảo quản này.Merthiolate là chất bảo quản được sử dụng rộng rãi nhất để bảo quản vắc-xin. Tuy nhiên, merthiolate có thủy ngân dưới dạng ethyl mercury. Thông thường, mỗi bệnh nhân nhiễm độc nặng sử dụng 15 lọ HTKNR, nhưng dùng đến 50 lọ HTKNR vẫn an toàn. Các nước: Nga, Đan Mạch, Úc, Nhật Bản, Anh và toàn bộ các nước vùng Scandinavian đều dùng merthiolate là chất bảo quản. Năm 1999, FDA khuyến cáo nên giảm hoặc loại bỏ merthiolate trong vắc-xin. Trung tâm nghiên cứu và lượng giá chế phẩm sinh học Hoa Kỳ đã gửi thư tới các cơ sở sản xuất vắc-xin yêu cầu có chương trình tiến tới không có merthiolate trong vắc-xin và chế phẩm sinh học, đặc biệt cho trẻ sơ sinh và trẻ em.
Tóm lại: căn cứ kết quả đánh giá chất lượng của Kiểm định cơ sở và của cơ quan Kiểm định quốc gia, chúng tôi khẳng định: HTKN-RCN đa giá F(ab’)2, nghiên cứu sản xuất từ huyết tương ngựa, đạt chất lượng tốt: An toàn và Hiệu lực theo tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam IV, 2009 và theo hướng
dẫn của WHO, 2008, đạt mục tiêu nghiên cứu đề ra. Kết quả này đã được sơ bộ chứng minh bằng thực tiễn lâm sàng (phụ lục).