- Với các thành công trên, Việt Nam là nước nghiên cứu, chế tạo thành công HTKN rắn cạp nia đơn giá của hai loài rắn cạp nia bắc, rắn cạp nia nam tương đối sớm hơn so với các nước
A: Rắn cạp nia bắc B: Rắn cạp nia nam C: Rắn khoang sông Hồng.
2.2.4.2. Chế tạo kháng nguyên nọc rắn cạp nia đa giá giảm độc lực:
- Chế tạo kháng nguyên nọc rắn cạp nia đa giá giảm độc lực: theo phương pháp của Trịnh Xuân Kiếm và khuyến cáo của WHO, 2008 [151]:
+ Trộn lẫn hai loại nọc rắn cạp nia bắc và nam, mỗi loại 1500 mg. Pha nọc đông khô trong dung dịch đệm BPS thành dung dịch nọc rắn cạp nia đa giá, nồng độ 1%. Trộn dung dịch glutaraldehyde 0,25% với dung dịch nọc theo tỷ lệ quy định, ủ ở 37oC/72 giờ/pH 7,3. Ủ tiếp ở 56oC/24 giờ.
+ Ly tâm lấy dịch nổi, lọc vô trùng dung dịch nọc, thu được kháng nguyên đa giá giảm độc lực. Đóng lọ, dán nhãn, ghi ngày sản xuất, khối lượng nọc, thể tích kháng nguyên, bảo quản ở 2 - 4oC.
- Kiểm tra chất lượng kháng nguyên theo Dược điển Việt Nam IV, 2009 [9].
Cobaye. Tiêm phúc mạc kháng nguyên với liều 1 ml/100g cho ba chuột, chuột thứ tư không tiêm (Dược điển Việt Nam IV, 2009, chuyên luận 15, liều cho phép < 5 ml)[9]. Theo dõi bảy ngày liên tiếp về hình thái (xù lông), giảm trọng lượng, giảm vận động, chết. Nếu có trên một chuột bị ốm (rụng lông, giảm trọng lượng...) hoặc chết là kháng nguyên không đạt an toàn.
+ Kiểm tra chất gây sốt trên thỏ: đo nhiệt độ hậu môn thỏ trước khi thí nghiệm; tiêm tĩnh mạch tai thỏ liều 1ml/kg cân nặng (Dược điển Việt Nam IV, 2009, chuyên luận 15, liều cho phép 1 ml/kg) [9]. Theo dõi nhiệt độ thỏ ba giờ liên tiếp, mỗi giờ một lần. Nếu trong ba giờ, nhiệt độ mỗi thỏ thay đổi dưới 1oC là đạt tiêu chuẩn kháng nguyên không có chất gây sốt.
+ Cấy khuẩn, cấy nấm: cấy 1ml kháng nguyên trong môi trường
Thioglycolate, để ở nhiệt độ 30-35oC/72 giờ, cấy 1ml kháng nguyên vào môi trường Sabouraud, để ở nhiệt độ 20-25oC, theo dõi trong bảy ngày. Nếu không mọc vi khuẩn, vi nấm là kháng nguyên đạt vô khuẩn, không có nấm. + Đánh giá hiệu lực sinh kháng thể bằng thử nghiệm Ouchterlony [26],[29]:
Sau khi gây mẫn cảm, lấy máu tĩnh mạch cổ ngựa, tách huyết thanh, đun sôi và trải gel agarose 1,5% lên phiến kính + đĩa petri trong suốt, đục một lỗ trung tâm và sáu lỗ đường kính 4 mm ở xung quanh. Nhỏ 10 µl kháng nguyên vào ô trung tâm, 10 µl huyết thanh ngựa vào mỗi ô với tất cả sáu ô xung quanh, ghi chép, đánh dấu vị trí kháng nguyên và huyết thanh, để vào hộp ẩm ở nhiệt độ 37OC và nhiệt độ lạnh 2-6oC, sau 6, 12, 24 giờ: xem kết quả. Nếu có đường tủa kháng nguyên - kháng thể, nhuộm đĩa và lam thạch agarose 1,5% với dung dịch Coomasie blue, tẩy màu bằng dung dịch tẩy màu
(Methanol, acetic acid, nước cất với tỷ lệ 4:1:5), rửa nước cất, để khô. Nếu có tủa giữa ô trung tâm và các ô xung quanh là huyết thanh ngựa có kháng thể chống nọc rắn cạp nia, kháng nguyên đạt yêu cầu về tính sinh miễn dịch.
+ Xác định tính đặc hiệu của kháng thể kháng nọc rắn cạp nia bằng điện di miễn dịch HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 và kháng nguyên nọc rắn.
2.2.4.3. Gây mẫn cảm cho ngựa, theo dõi hình thành KT đặc hiệu:
- Gây mẫn cảm cho ngựa theo khuyến cáo của WHO [151] với lịch trình miễndịch 1 tháng/lần x 9 tháng. Tiêm kháng nguyên trộn lẫn tá dược Fruend hoàn