- Dựa trên kết quả ở bảng 3.21, tính LD50 theo công thức của Karber (theo Nguyễn Xuân Phách, Nguyễn Thế Minh, 1995)[27]:
Z: số trung bình tử vong củ a2 nhóm kế cận d: khoảng cách liều lượng giữa các nhóm.
4.2.1.2. Hiệu lực của chế phẩm nghiên cứu:
Theo kết quả bảng 3.21, đã xác định được liều chết trung bình (LD50) của nọc rắn cạp nia Việt Nam (gồm cả hai loài rắn cạp nia bắc và nam) là 2,17 µg/chuột (18-20 g). Đây là công việc bắt buộc trước khi tính ED50.
Ngay khi tiến hành thử nghiệm, đếm số chuột sống chết đã xác định nhanh LD50 = 2 µg/chuột nhắt trắng. Tuy nhiên, để chính xác, nhóm nghiên cứu cần phải tính toán. Khi tính LD50, chúng tôi đã sử dụng công thức tính LD50 của G. Karber [27]: LD50 = LD100 – (Z d/n). Trong đó: Z là số trung bình tử vong của 2 nhóm kế cận, d: khoảng cách liều lượng giữa các nhóm, n: số động vật thử nghiệm trong từng nhóm. Sau khi tính toán cụ thể cho kết quả LD50 = 2,17 µg/chuột nhắt trắng (18 - 20g). So sánh tính toán và đếm nhanh, chúng tôi thấy tương đương (2,17 & 2), tính toán theo công thức chính xác hơn 0,17 µg. Như vậy, nhóm nghiên cứu đã pha loãng nọc rắn với hệ số 1,5 lần (bảng 3.21), khác so với độ pha loãng tính theo Dược điển Việt Nam IV,
2009 (theo Dược điển, bậc pha loãng là 1,2 hoặc 1,4 lần). Cách tính LD50 theo công thức Karber đã được chúng tôi lựa chọn do dễ sử dụng, dễ tính toán hơn so với các công thức tính LD50 khác, song vẫn đảm bảo độ chính xác. Liều chết 50% (Lethal Dose 50%) - LD50 trên chuột nhắt trắng trọng lượng 18-20g/con đã được WHO khuyết cáo cách tính toán từ năm 1971 và vẫn được nhắc lại trong các khuyến cáo gần đây. Tuy nhiên, WHO không quy định cụ thể phải tính theo công thức tính LD50 nào, của ai [151],[27],[105]. Dược điển Việt Nam III và IV quy định cụ thể cách tính LD50 theo Spearman – Karber tính toán phức tạp hơn cách chúng tôi đã sử dụng (phương pháp Karber, Nguyễn Xuân Phách, Nguyễn Thế Minh, 1995) [27]. Phần này đã nêu trong chương 2, đối tượng và phương pháp nghiên cứu, mục Kiểm định quốc gia, cách tính LD50 và ED50.
Việc pha nọc rắn xác định LD50 tiến hành theo nhiều nồng độc khác nhau. Nước muối sinh lý dùng làm dung môi pha loãng nọc, sao cho thể tích dịch nọc mỗi lần tiêm tĩnh mạch đuôi chuột nhắt trắng Swiss 10 - 20 gam là 0,2 ml/con, tiêm phúc mạc chuột là 0,5 ml/con. Thời gian theo dõi chuột tiêm tĩnh mạch là 24 giờ, tiêm phúc mạc là 48 giờ. Từ đó ghi nhận liều nọc gây chết chuột từ 0% đến 100% và liều nọc gây chết một nửa số chuột thí nghiệm (LD50).Qua đó, xác định mức độ độc của nọc. Theo bảng 3.21, LD50 nọc rắn cạp nia đa giá
là 2,17 µg trên chuột nhắt trắng 18 - 20g, cao hơn so với LD50 nọc B. candidus Thái Lan trong nghiên cứu của Chanhome L. et al., 2009 (0,053 - 0,070 µg/g)[50], và của B.candidus
Malaysia trong nghiên cứu của Tan N.H et al., 2004 (0,1 µg/g) [135], đồng thời cũng thấp hơn LD50 rắn cạp nia bắc (B.multicinctus) trong nghiên cứu của Steven D., 1999 (0,15 µg/g) [131].
Hiệu lực trung hòa hoạt tính độc của nọc là mục tiêu của sản xuất
HTKNR (Peres C.M.; Bastos F.M., et al, 2006)[114]. Bước quan trọng là thực hiện các thử nghiệm tiền lâm sàng cả trong phòng thí nghiệm và trên động vật, xác định khả năng trung hòa nọc độc của HTKNR, bao gồm khả năng cứu sống động vật, chống chảy máu, chống tiêu sợi huyết, chống hoại tử, trung hòa độc tố thần kinh… do nọc gây nên. Đầu tiên phải xác định hoạt tính gây chết của nọc, liều gây chảy máu tối thiểu (Minimum haemorrhagic dose - MHD), liều đông tối thiểu của nọc tác động lên sợi huyết và huyết tương (Minimum coagulant dose- fibrinogen & plasma: MCD-F, MCD-P). Xác định hiệu lực trung hòa nọc 50% (ED50) của HTKNR là tiêu chuẩn so sánh
HTKNR giữa các lô của một cơ sở sản xuất với các cơ sở khác. Chuột nhắt trắng nên dùng nhóm 5 - 6 con, trọng lượng 18 - 20 g/con. Dung dịch nọc cố định trộn đều với HTKNR (tăng dần). Đường tiêm tĩnh mạch là phổ biến, đôi khi cũng dùng đường tiêm phúc mạc. Theo dõi 24 giờ số lượng chuột sống 50% sau khi tiêm tĩnh mạch hỗn dịch nọc và HTKNR chính là khả năng bảo vệ hay hiệu lực của HTKNR. Tuy nhiên, chủng loại chuột nhắt trắng, số lượng nọc (LD50) để trộn với HTKNR, đường tiêm cho chuột… luôn được lưu ý để kết quả thí nghiệm đạt yêu cầu đồng khả năng thì so sánh mới có ý nghĩa.
Các thí nghiệm xác định khả năng trung hòa của HTKNR với các hoạt tính đặc biệt như chảy máu, phù nề, tiền đông, tiêu hủy sợi huyết, hoại tử không thực hiện thường qui. Tuy nhiên, khi cần, có thể tham khảo tài liệu
hướng dẫn của WHO. Cần có HTKNR và nọc tiêu chuẩn tham chiếu để so sánh, đánh giá chất lượng. Vì vậy, mỗi quốc gia, mỗi khu vực cần có tiêu chuẩn tham chiếu nọc và HTKNR của địa phương mình.
Điểm thống nhất chung là các thử nghiệm trên động vật rất tốn kém. Mối tương quan về nhiễm độc từ động vật tới điều trị trên người rất hạn chế hoặc không rõ. Gần đây, các quốc gia Âu-Mỹ đề nghị không nên thử nghiệm gây chết trên chuột. Từ đó các tác giả đưa ra thử nghiệm trên phôi gà thay thế thử nghiệm trên động vật. Theo dõi phôi gà sống hoặc chết phản ánh khả năng trung hòa của HTKNR với liều chết của nọc. Kỹ thuật này cũng được áp dụng để xác định hoạt tính gây chảy máu của nọc và khả năng trung hòa của
HTKNR bằng cách đo đường kính vùng chảy máu khi nhỏ nọc, so sánh với kết quả khi nọc đã được ủ trước với HTKNR. Giá thành thử nghiệm loại này cũng rất rẻ. Tuy nhiên, thử nghiệm trên phôi gà lại không áp dụng được với độc tố thần kinh.
Trong kiểm tra chất lượng HTKNR, trước hết là xét nghiệm xác định khả năng trung hòa nọc độc (Neutralization potency test). Đây là khâu quyết định hiệu quả của thuốc. Nọc rắn độc là nguyên nhân đe dọa tính mạng, đang tồn tại trong cơ thể nạn nhân, phải được trung hòa, loại bỏ càng nhanh càng tốt. Kết quả nghiên cứu đã xác định hai xét nghiệm về hiệu lực, đó là: liều gây chết 50% (LD50) của nọc rắn cạp nia là 2,17 µg/chuột (20g) và liều hiệu lực trung hòa, có khả năng giải độc cứu người của HTKN cạp nia đa giá F(ab’)2 (ED50) của loạt sản xuất nghiên cứu này là 57.14 LD50/ml = 124.2 µg/ml. Kỹ thuật được tiến hành theo khuyến cáo của WHO, tại Đơn vị nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng nọc, Trung tâm chống độc, bệnh viện Bạch Mai. Kết quả này phù hợp với “Phiếu trả lời kết quả kiểm định số: 00610/SPĐT-NC của Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, ngày 1/12/2010.