- 12/2011: Bảo vệ luận án cấp cơ sở.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.4.1. Cắt Fc bằng pepsin, tủa protein không phải KT bằng ammonium sulphate 14%; lọc bỏ tủa bằng giấy lọc Whatman, thu dịch lọc có F(ab’)2 :
sulphate 14%; lọc bỏ tủa bằng giấy lọc Whatman, thu dịch lọc có F(ab’)2:
Bảng 3.12. Thể tích dịch lọc có F(ab’)2 thu được. Chỉ số NC
Lô NC
Huyết tương đưa vào sản xuất (ml) Dịch lọc thu được có KT (ml) Tỷ lệ dịch lọc thu được/huyết tương sx (%) Lô 1 3600 2900 80,6% Lô 2 6400 5140 80,3% Cộng : 10.000 8040 80,4%
Biểu đồ 3.2. Thể tích dịch lọc có F(ab’)2 trong 2 lần tinh chế.
- Lần tinh chế thứ nhất (lô 1): lấy máu lần đầu ở hai ngựa nghiên cứu tách từ 5,9 lít máu ngựa (bảng 3.11) được 3,6 lít huyết tương.
- Lần tinh chế thứ hai (lô 2): lấy máu lần hai ở hai ngựa thu được 10,6 lít máu (bảng 3.11), tách được 6,4 lít huyết tương.
ammonium sulphate 14%; lọc bỏ tủa bằng giấy lọc Whatman, thu dịch lọc có F(ab’)2: số dịch lọc cả thu được là 8,04 lit (lô thứ nhất thu được 2,9 lít; lô thứ hai thu được 5,140 lít).
- Tỷ lệ thu lại dịch lọc chứa kháng thể kháng nọc RCN đa giá ở lô thứ nhất là 80,6%; ở lô thứ hai là 80,3%; cả hai lô là 80,4%.
3.1.4.2. Tủa F(ab’)2 với ammonium sulfate 22%, lọc thu tủa bằng giấy lọc Whatman, thẩm tích và lọc vô trùng tạo HTKN-RCN F(ab’)2. Whatman, thẩm tích và lọc vô trùng tạo HTKN-RCN F(ab’)2.
Bảng 3.13. Lượng tủa có F(ab’)2 thu được. Chỉ số NC
Lô NC
Dịch lọc có chứa F(ab’)2
(ml)
Lượng tủa có F(ab’)2
thu được (gam)
Lô 1 2900 210
Lô 2 5140 395
Cộng 2 lần tinh chế 8040 605
- Lần tinh chế thứ nhất (Lô 1): 2900 ml dịch lọc sau khi tủa phân đoạn với ammonium sulfate 22%, lọc thu tủa chứa F(ab’)2 đặc hiệu chống nọc RCN ở nhiệt độ 20oC, pH 6,8/60’; thu được 210g tủa lẫn muối ammonium sulfate. - Lần tinh chế thứ hai (Lô 2): 5140 ml dịch lọc sau tủa phân đoạn như lần đầu, thu được 395g tủa.
- Tổng cộng cả hai lần tủa 8040 ml dịch lọc chứa kháng thể đặc hiệu kháng nọc rắn cạp nia đa giá, thu được 605 gam tủa kháng thể dạng F(ab’)2 lẫn muối ammonium sulfate.
Bảng 3.14. Lượng dịch thẩm tích và HTKN-RCN đa giá bán thành phẩm. Chỉ số N/C Lô N/C Dịch thẩm tích (ml) HTKN-RCN bánthành phẩm (ml) Lượng dịch thẩm tích bị hao hụt (ml)
Lô 1 190 165 25 (13,1%)
Lô 2 510 485 25 (5,2%)
∑ 2 lần tinh chế 700 650 50 (7,7%)
Biểu đồ 3.3. Lượng dịch thẩm tích và HTKNR đa giá F(ab’)2 thu được.
- Sau khi làm khô tủa chứa F(ab’)2 đặc hiệu gắn với ammonium sulfate; thẩm tích với nước cất cho đến khi sạch muối ammonium sulfate, lô thứ nhất thu được 190 ml, lô thứ hai thu được 510 ml dịch thẩm tích chứa mảnh F(ab’)2. Cả hai lô thu được 700 ml HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 dạng bán thành phẩm. - Lọc vô trùng dịch thẩm tích đã sạch ammonium sulphate bằng máy lọc Seitz,
màng cellulose acetate, đường kính lỗ lọc 0,45 µm và 0,2 µm; lô thứ nhất thu được 165 ml; lô thứ hai thu được 485ml.
- Hao hụt sau lọc của hai đợt tinh chế là 25 ml, chiếm 7,7% lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đã sản xuất.
Bảng 3.15. Số lượng HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đã sản xuất.
Tên sản phẩm Đơn vị Thể tích (ml) Số lượng (lọ) HTKN-RCN bán thành phẩm Chai 500 ml 650 2 HTKN-RCN F(ab’)2 Lọ 5 ml 650 130
- Tổng số 650 ml HTKN-RCN F(ab’)2 bán thành phẩm chưa qua kiểm định chất lượng ở cơ sở sản xuất được đóng vào hai chai vô khuẩn có thể tích 500 ml (chai lô 1: 165 ml và chai lô 2 là 485 ml), bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8oC. Sau
khi trộn lẫn HTKN-RCN bán thành phẩm của hai lần tinh chế, lấy mẫu HTKNR bán thành phẩm thử nghiệm kiểm định chất lượng cơ sở.
- Số lượng lọ HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đã sản xuất, chưa kiểm định chất lượng là 130 lọ, thể tích 5 ml/lọ. Sau kiểm định cơ sở có kết quả, đạt yêu cầu, tiến hành lấy mẫu trong số 130 lọ HTKN-RCN này, gửi kiểm định tại Viện Kiểm định quốc gia Vắc xin và sinh phẩm y tế, Bộ y tế để đánh giá chất lượng sản phẩm cấp độ quốc gia.
Bảng 3.16. Nguyên liệu, hóa chất đã sử dụng tinh chế HTKN-RCN đa giá. Tên nguyên liệu, hóa chất Lô I Lô II Cả 2 lần tinh chế
Huyết tương sản xuất (lít) 3,6 6,4 10,0
Pepsin đã sử dụng (gam) 3,6 6,4 100
Ammoni sulfate 14% (gam) 504 896 1400
Ammoni sulfate 22% (gam) 638 1130,8 1768
Lượng tủa có F(ab')2 (gam) 210 495 605
Dịch thẩm tích chứa F(ab’)2 (ml) 190 510 700
HTKN F(ab')2 (ml) 165 485 650
Merthiolat 1% (gam) 36 64 100
- Tinh chế hai đợt, tổng cộng 10 lít huyết tương, thu được 8,04 lít dịch lọc chứa F(ab')2 kháng nọc RCN đặc hiệu; tủa phân đoạn thu được 605 gam tủa F(ab')2 lẫn ammonium sulphate, thẩm tích với nước cất, thu được 700 ml dịch thẩm tích chứa F(ab’)2 đặc hiệu với nọc RCN; lọc vô trùng, thu được HTKN-RCN đa giá bán thành phẩm dạng F(ab’)2.
- Lượng pepsin dùng tinh chế là 100 gam.
tinh chế, tủa phân đoạn với ammonium sulphate 14% là 1400 gam và ammonium sulphate 22% là 1768 gam.
- Lượng chất bảo quản merthiolat (1%) cho vào huyết tương từ đầu giai đoạn tinh chế của cả hai đợt là 100 gam.