- Dựa trên kết quả ở bảng 3.21, tính LD50 theo công thức của Karber (theo Nguyễn Xuân Phách, Nguyễn Thế Minh, 1995)[27]:
4.1.2.Qui trình gây mẫn cảm ngựa, theo dõi đáp ứng miễn dịch:
Z: số trung bình tử vong củ a2 nhóm kế cận d: khoảng cách liều lượng giữa các nhóm.
4.1.2.Qui trình gây mẫn cảm ngựa, theo dõi đáp ứng miễn dịch:
Quá trình gây mẫn cảm, chăm sóc theo dõi sức khỏe ngựa, theo dõi hình thành kháng thể đặc hiệu là quãng thời gian rất quan trọng, có ý nghĩa quyết định tiếp theo sau khâu chế tạo kháng nguyên nọc rắn đa giá giảm độc lực. Giai đoạn này, đòi hỏi phải chăm sóc ngựa thật tốt để ngựa đủ sức chịu đựng quá trình mẫn cảm với lượng kháng nguyên và tá dược ngày càng nhiều. Việc tiêm kháng nguyên và tá dược phải bảo đảm kỹ thuật, đúng vị trí, đúng liều lượng dự kiến. Đi kèm theo là việc đánh giá kết quả đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên đã chế tạo, khẳng định chất lượng kháng nguyên và quá trình gây mẫn cảm, quyết định các thay đổi về liều lượng kháng nguyên, tá dược, cách thức, vị trí gây mẫn cảm cho phù hợp, thậm chí quyết định cả phương pháp chăm sóc, chế độ ăn uống cụ thể trong từng tình huống. Đây là thời gian vất vả nhất của cán bộ nghiên cứu do phải làm việc nhiều với động vật trong môi trường kém vệ sinh và không ít nguy hiểm. Do yêu cầu nghiên cứu, mọi công việc vẫn phải đảm bảo cẩn thận, tỉ mỉ, trực tiếp và cụ thể sát sao theo diễn biến của từng ngựa nghiên cứu.
trọng lượng phân tử, cấu trúc, khả năng hòa tan của kháng nguyên,... đáp ứng miễn dịch ở ngựa gây mẫn cảm còn phụ thuộc vào đặc điểm sinh học riêng của cá thể ngựa gây mẫn cảm, liều lượng kháng nguyên và tá dược (Đỗ Trung Phấn, 1979) [28]. Như khuyến cáo của WHO (Guidelines, 2008), với ngựa gây mẫn cảm, quãng cách thời gian giữa hai lần tiêm kháng nguyên và tá dược khoảng từ 3 - 5 tuần. Đây là khoảng thời gian cần thiết bảo đảm an toàn cho ngựa sau miễn dịch, đảm bảo liền vết loét chỗ tiêm, ngựa không còn mệt yếu, đủ sức khỏe cho lần mẫn cảm tiếp theo. Nghiên cứu của chúng tôi đã để thời gian một tháng/lần gây mẫn cảm, tuy mất thời gian hơn so với lịch trình 3 tuần/lần, nhưng nhờ có thời gian, việc chăm sóc đã giúp ngựa phục hồi sức khỏe tốt hơn, sẵn sàng cho lần gây mẫn cảm tiếp theo. Xét khía cạnh kinh tế, nên theo một lịch trình ngắn hơn, khoảng hai đến ba tuần/lần (Philadelphia Wahby et al., 2010 [115], Clara, Miller, 1971 [20]). Điều này cũng tùy điều kiện của nhà nghiên cứu, diễn biến sức khỏe ngựa (loét, bỏ ăn, bại liệt,..). Có tác giả cho rằng có thể dự kiến lịch trình miễn dịch trong3-15 tháng, với 10 – 50 mũi tiêm kháng nguyên và tá dược Chippaux J.P, Goiffon M. (1992) [54]. Về liều lượng kháng nguyên gây mẫn cảm, trong nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng liều đầu tiên rất nhỏ (0,1 ml kháng nguyên chứa 1,1 mg nọc rắn cạp nia) - ngay cả khi không khử độc, liều này cũng không nguy hiểm cho ngựa (320 kg). Các lần gây mẫn cảm tiếp theo, đã sử dụng liều lượng tăng dần. Độc tố nọc rắn cạp nia cực độc, nếu khử độc không tốt, sẽ nguy hiểm với ngựa khi sử dụng liều cao. Liều cao nhất khi gây mẫn cảm là 6 ml kháng nguyên, chứa ≈ 66 mg nọc rắn cạp nia. Khi tiêm cho ngựa có trọng lượng 320 kg, liều này tương ứng 3,7µg/chuột Swiss 18 - 20g; cao hơn liều chết 50% của nọc rắn cạp nia (LD50 = 2,17 µg). Theo Steven D. et al. (1999) LD50 của rắn cạp nia bắc là 0,15µg/gam [131]; theo Tan N.H, (2004) LD50 của rắn cạp nia nam là
dùng khi tiêm đủ 6 ml KN. Liều này quá mạnh, đủ sức gây chết ngựa nếu KN không khử được hết độc tính nọc. Như vậy, do kháng nguyên được khử độc hoàn toàn và đã thử nghiệm xác định đảm bảo an toàn trên chuột lang Cobaye và thỏ thí nghiệm (bảng 3.4 và 3.5), liều này đã được sử dụng và thực tế cho thấy ngựa nghiên cứu vẫn khỏe mạnh.
Về sử dụng tá dược: do độc tố thần kinh trong nọc rắn cạp nia có trọng lượng phân tử thấp, tính sinh miễn dịch yếu, sử dụng tá dược Freund’s phối hợp với kháng nguyên là cần thiết. Tá dược Freund’s mang tên Jules Freund, người phát minh ra tá dược. Đó là một huyền dịch kháng nguyên được nhũ hóa (emulsify) trong dầu khoáng, để tăng cường độ đáp ứng miễn dịch
(immunopotentiator). Tá dược Freund’s đã nhũ hóa, tạo thành huyền dịch gồm các tiểu phân cực nhỏ, chứa kháng nguyên nọc (dịch treo) lơ lửng trong môi trường, kéo dài thời gian tồn tại của kháng nguyên tại nơi vết tiêm kháng nguyên. Trực khuẩn lao đã xử lý không còn vai trò gây bệnh cho cơ thể chủ, nhưng lại là yếu tố kích thích đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, làm tăng tiềm năng sinh γ-globulin miễn dịch IgG bằng cách tạo ra ổ viêm tại chỗ, kêu gọi các tế bào có thẩm quyền miễn dịch tới ổ viêm để xử lý tác nhân gây viêm; qua đó nhận biết nhóm quyết định kháng nguyên nọc rắn cạp nia, thông tin cho toàn hệ thống miễn dịch của cơ thể ngựa, phát động quá trình đáp ứng sinh kháng thể đặc hiệu (Nguyễn Năng An, 1975[2]). Tế bào trí nhớ miễn dịch (memory cells) có chức năng nhận biết và ghi nhớ các dấu ấn miễn dịch của kháng nguyên. Khi được tiêm liều kháng nguyên nọc rắn cạp nia nhắc lại, tế bào trí nhớ miễn dịch lập tức được phát động, nhân lên gấp bội để sinh kháng thể IgG (Nguyễn Năng An, Trương Đình Kiệt, 1986) [1]. Nhiều tác giả đã sử dụng phương pháp kết hợp kháng nguyên và CFA để tăng mạnh hiệu giá kháng thể cho thấy hiệu quả rất rõ rệt. Pratanaphon R et al., (1997) [116], đã trộn lẫn kháng nguyên nọc rắn hổ đất Thái Lan và với các tá dược khác nhau, tỷ dụ CFA đơn thuần (50% CFA + 50% KN) hoặc CFA với tỷ lệ 25% (75%
kháng nguyên và 25% CFA), hoặc kháng nguyên + vắc xin nội độc tố uốn ván (tetanus toxoid), kháng nguyên + vắc xin nội độc tố bạch hầu (diphtheria toxoid ) với tỷ lệ khác nhau, thu được kết quả tốt, hiệu giá kháng thể tăng cao mạnh mẽ trong thời gian ngắn so với nhóm chứng chỉ dùng kháng nguyên và tá dược là bentonite gel.
Chúng tôi đã tự chế tá dược theo công thức của hãng Difco để tiết kiệm chi phí. CFA, gồm: mannide monooleate (1,5ml), dầu paraffin (8,5ml) và trực khuẩn lao chết đông khô (Mycobacterium tuberculosis): 5-10 mg; IFA gồm: mannide monooleate (1,5ml), dầu paraffin (8,5ml), không có trực khuẩn lao. Kháng nguyên và tá dược đóng lọ riêng biệt. Trước khi tiêm miễn dịch ngựa, tá dược được trộn thật kỹ với kháng nguyên theo tỷ lệ 1/1. Kháng nguyên nọc rắn cạp nia đa giá được tiêm dưới da ở nhiều vị trí tiêm khác nhau (hơn 10 điểm tiêm) theo khuyến cáo của WHO & hãng Difco. Kết quả: ngựa khỏe, đáp ứng sinh kháng thể mạnh.
Về đường tiêm kháng nguyên + tá dược: trong quá trình gây mẫn cảm, ngựa hoàn toàn được tiêm dưới da vì theo khuyến cáo của WHO, trong các đường tiêm, đường tiêm dưới da là tốt nhất, tránh được nguy cơ gây loét, hoại tử, tróc da nếu tiêm trong da; gây què quặt tạm thời hoặc vĩnh viễn nếu tiêm bắp thịt; gây tắc mao mạch phổi nếu tiêm đường tĩnh mạch. Các khu vực tiêm kháng nguyên và tá dược đã được áp dụng theo khuyến cáo của WHO. Liều kháng nguyên và tá dược được chia đều với nhiều điểm tiêm cùng kỹ thuật tiêm gây mẫn cảm đúng giúp ngựa bớt đau, đi lại cử động dễ dàng, không bị nhiễm trùng lan tỏa. Theo bảng 3.7 cho thấy, tổng liều kháng nguyên và tá dược ngày càng tăng, khiến cho việc phân chia các điểm tiêm kháng nguyên và tá dược phải tính toán trước. Với tá dược CFA, cần chia ra nhiều điểm tiêm và khoảng cách tiêm giữa các điểm phải được cân nhắc cụ thể tùy tình trạng loét da ngựa. Điều này nhằm tránh cho vết loét da rộng quá hoặc lâu liền,
chăm sóc đỡ vất vả, lần miễn dịch sau dễ dàng hơn. Theo WHO, nên tiêm tá dược CFA một lần duy nhất, sau đó chỉ tiêm kháng nguyên và tá dược IFA vẫn làm tăng tính sinh miễn dịch của kháng nguyên nhưng không gây tình trạng loét da ngựa. Trong nghiên cứu này chúng tôi chưa áp dụng.
Như vậy, công đoạn gây mẫn cảm cho ngựa đã hoàn thành tốt với sự phối hợp lịch trình miễn dịch với liều lượng kháng nguyên và tá dược Freund’s. Đây là một giai đoạn quan trọng trong quá trình sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn cạp nia đa giá F(ab’)2. Kết quả gây mẫn cảm ngựa khẳng định một lần nữa kháng nguyên nọc rắn cạp nia đa giá được chế tạo đạt chất lượng tốt, an toàn cho động vật miễn dịch.
Theo dõi, chăm sóc ngựa sau mỗi lần mẫn cảm là việc vất vả, đòi hỏi có khoa học; trong suốt thời gian chín tháng của lịch trình gây mẫn cảm, đến khi lấy máu ngựa, thu huyết tương giàu kháng thể đặc hiệu chống nọc rắn. Nếu chăm sóc không đảm bảo, ngựa có thể tử vong hoặc mắc bệnh, sinh kháng thể không tốt, hiệu giá kháng thể không cao. Điều này đã được WHO cảnh báo và là một vấn đề rất quan trọng trong số các giải pháp góp phần làm tăng hiệu giá kháng thể trong sản xuất HTKNR nói chung.
Trước hết, sau khi tiêm kháng nguyên và tá dược gây mẫn cảm, cần theo dõi các biểu hiện toàn thân, tại chỗ của ngựa và xử trí kịp thời. Bảng 3.8 chỉ ra: khi tiêm kháng nguyên và tá dược Freund’s cho hai ngựa nghiên cứu, thấy các biểu hiện ở hai ngựa sau tiêm xảy ra tương tự nhau. Ngay những ngày đầu sau khi tiêm kháng nguyên và tá dược CFA ở cả hai ngựa nghiên cứu đều thấy các biểu hiện mệt mỏi, bỏ ăn, yếu bại, ngựa nằm tại chỗ không đứng dậy được, thở nông và nhanh, tại chỗ tiêm dần dần xuất hiện vết loét, đường kính 2 - 7 cm. Trong những lần gây mẫn cảm tiếp theo, KN được trộn với tá dược Freund’s không hoàn toàn (IFA), thấy biểu hiện toàn thân, vận động, tiêu hóa, hô hấp của ngựa gần như bình thường, ngựa vẫn đi lại, ăn uống, không cần chăm sóc, đặc biệt không thấy xảy ra hiện tượng loét da.
Loét da nơi tiêm xảy ra sau miễn dịch ngựa bằng tá dược Freund’s hoàn toàn (CFA) nhưng không xuất hiện khi miễn dịch với tá dược IFA đặt ra câu hỏi phải chăng loét da ngựa là do BCG có trong thành phần tá dược Freund’s hoàn toàn? Khi kháng nguyên đã được xác định an toàn trên chuột lang với liều tiêm phúc mạc chuột là 1 ml/100 gam trọng lượng (bảng 3.4), đây là liều lớn gấp 90 lần LD50 đối với chuột lang thí nghiệm nặng 250 - 300 gam. Trong quá trình gây mẫn cảm, liều kháng nguyên từ 0,1 ml khởi đầu đã được nâng cao
dần đến 6 ml (bảng 3.7), tương đương 1,1 mg/kg ---> 66 mg/kg trọng lượng ngựa 320kg. Trừ những lần tiêm đầu tiên, những liều tiêm kháng nguyên cuối cùng có nồng độ nọc sử dụng cao hơn LD50 của nọc rắn cạp nia (3,7 µg so với 2,17 µg/chuột nhắt trắng Swiss 18 – 20g), nếu không khử độc, sẽ gây nguy hiểm cho ngựa. Với việc hoàn thành quá trình gây mẫn cảm, một lần nữa khẳng định kháng nguyên nọc rắn cạp nia đa giá được chế tạo là thực sự an toàn. Hiện tượng loét da xảy ra sau khi tiêm kháng nguyên và tá dược CFA do trong thành phần tá dược có BCG chết, gây phản ứng viêm rất mạnh, tương tự tiêm vắc xin phòng lao ở người (Hiện tượng Koch, Nguyễn Năng An, 1975[2]). Điều này cũng phù hợp với khuyến cáo của WHO khuyên chỉ nên tiêm một lần CFA và hạn chế việc tiêm tại một điểm một số lượng lớn kháng nguyên và tá dược. Có nhiều ý kiến khác nhau về vấn đề này; dùng kháng nguyên và tá dược thế nào còn tùy theo quan điểm, kinh nghiệm của các cơ sở nghiên cứu, của từng tác giả (Đỗ Trung Phấn, 1979) [28].
Riêng về chăm sóc các vết loét da ngựa sau gây mẫn cảm là một vấn đề rất cần chú ý. Do chuồng ngựa không thể đảm bảo vệ sinh, vết loét chắc chắn bị nhiễm trùng, ruồi bâu bám,...nên càng lâu liền. Thông thường, việc sát khuẩn vết thương hoặc băng vết loét cho ngựa rất khó khăn. Nếu vết thương rộng và ở vị trí vận động (vùng cổ và ức ngựa) hầu như không thể băng hay đắp gạc mà phải bắt buộc để hở, ảnh hưởng đến sức khỏe ngựa và không còn vị trí để tiêm kháng nguyên và tá dược trong những lần gây mẫn cảm về sau. Một điểm nữa cần nói đến, sẽ là thuận lợi hơn nếu việc chăm sóc ngựa có nhân viên chuyên nghiệp, hiểu biết về tập tính, các bệnh thường gặp, các loại thức ăn ưa thích có giá trị dinh dưỡng cao của ngựa,... Người chăn và chăm sóc ngựa chuyên nghiệp sẽ tạo được sự thân thiện dễ gần với ngựa, giúp cho tiếp cận ngựa gây mẫn cảm, lấy máu dễ dàng hơn, bảo đảm an toàn, không bị ngựa đá hay dứt đứt dây trói khi lấy máu. Ngoài ra, cần đảm bảo nước uống sạch cho ngựa, cung cấp các loại rơm cỏ không có hóa chất bảo vệ thực vật, đủ thức ăn thô và tăng cường thức ăn tinh; che chắn chuồng trại cẩn thận, nhất là vào mùa đông, thời tiết giá lạnh, rét đậm rét hại....Ngựa béo khỏe là một dấu hiệu tốt báo hiệu thuận lợi cho việc sinh kháng thể có hiệu quả.
Chế tạo kháng nguyên đã thành công khi đảm bảo an toàn cho ngựa miễn dịch (bảng 3.8), tuy nhiên, mục đích cuối cùng của nghiên cứu là chế tạo HTKN rắn cạp nia đa giá F(ab’)2 đặc hiệu. Vì vậy, tạo nguồn huyết tương ngựa có hiệu giá kháng thể kháng nọc rắn cạp nia cao là hết sức quan trọng.
Theo dõi sự hình thành KT miễn dịch kháng nọc rắn cạp nia đa giá là công việc cần thiết, được làm thường xuyên trong quá trình gây mẫn cảm.
Kết quả bảng 3.9 cho thấy, sau miễn dịch chín lần, hiệu giá kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn cạp nia tăng lên mức 2048 ở cả hai ngựa và ổn định sau lần miễn dịch thứ tám và chín. Đây là mức đạt yêu cầu của kế hoạch nghiên cứu. So sánh mức độ tăng hiệu giá kháng thể với khoảng thời gian miễn dịch của các loại HTKNR khác như rắn hổ đất, rắn hổ chúa; hiệu giá kháng thể ở rắn cạp nia ở ngựa tăng tương đương. Với rắn choàm quoạp và rắn lục, thời gian đạt hiệu giá này sớm hơn, do đó có thể lấy máu sớm hơn sau bảy lần miễn dịch bằng kháng nguyên nọc rắn cạp nia và tá dược.
Kết quả bảng 3.9 cũng cho thấy, với hai ngựa khỏe mạnh, có cân nặng gần như tương đương và được nuôi ở hai địa điểm khác nhau, cùng một liệu trình miễn dịch với liều lượng như nhau, có thể cho kết quả hiệu giá kháng thể khác nhau. Điều này cho thấy chế độ dinh dưỡng, đặc điểm sinh học cá thể động vật gây mẫn cảm đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch của ngựa. Ngựa số 2 nuôi tại Thư Phú, Thường Tín, có chế độ dinh dưỡng tốt hơn đã đạt hiệu giá kháng thể cao hơn ngay từ sau lần miễn dịch đầu tiên. Điều này phù hợp với nhận định của Daltry J.C et al.,1996 [60].
Sau khi chế tạo kháng nguyên, kiểm tra đã có kháng thể đặc hiệu hình thành trong máu ngựa hay không là việc rất quan trọng. Chúng tôi dùng thử nghiệm Ouchterlony để kiểm tra thường xuyên hàng tháng sau khi gây miễn dịch. Kháng nguyên sử dụng là kháng nguyên nọc rắn cạp nia (bắc + nam), được bố trí ở trung tâm của lam thạch agarose 1,5%, xung quanh để huyết thanh ngựa đã gây miễn dịch. Kết quả nêu ở mục 3.1.2.4 cho thấy: vết tủa KN - KT trên thạch cho thấy trong máu ngựa đã hình thành kháng thể chống kháng nguyên nọc rắn cạp nia. Pha huyết thanh với nồng độ khác nhau, đặt ở các vị trí khác nhau để xem xét mức độ hình thành tủa KN - KT. Thử nghiệm
này có độ nhạy không cao, phụ thuộc nhiều yếu tố, so với thử nghiệm ELISA, tuy nhiên, do điều kiện không cho phép, thử nghiệm Ouchternoly là một lựa chọn cần thiết.
Để khẳng định kết quả sinh kháng thể và xác định tính đặc hiệu với kháng nguyên nọc, sau khi sản xuất được HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 thành