- Với các thành công trên, Việt Nam là nước nghiên cứu, chế tạo thành công HTKN rắn cạp nia đơn giá của hai loài rắn cạp nia bắc, rắn cạp nia nam tương đối sớm hơn so với các nước
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU:
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU:
2.1.1. Động vật thí nghiệm:
Ngựa (horse): ngựa đực 3 - 4 tuổi, khỏe mạnh, trọng lượng 300 và 320 kg; chăm sóc, nuôi dưỡng trong trang trại riêng biệt, đảm bảo các điều kiện môi trường và dinh dưỡng, đủ thức ăn thô và tinh, cỏ không phun thuốc bảo vệ thực vật, nước uống sạch: 2 con.
Thỏ (rabbit): khỏe, trọng lượng 2,5 - 3,0 kg/con, nuôi trong môi trường ổn định nhiệt độ, chưa từng được sử dụng vào thí nghiệm khác, 6 con.
Chuột lang (Cobaye), khỏe, nuôi dưỡng đầy đủ, chưa từng được sử dụng vào thí nghiệm khác, trọng lượng 250 - 300 gam/con, 6 con.
Chuột nhắt trắng (Swiss), 3 tuần tuổi, khỏe, trọng lượng 18 - 20 gam/con, nuôi dưỡng tốt, chưa từng được sử dụng vào thí nghiệm khác, 100 con.
Rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus), rắn cạp nia nam (Bungarus candidus): khỏe, đủ các độ tuổi, tuyển chọn ngẫu nhiên ở các vùng miền
khác nhau (đồng bằng, miền núi, ven sông...), số lượng > 100 con.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu:
Nọc rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus), nọc rắn cạp nia nam
(Bungarus candidus) đông khô, bảo quản đông lạnh: 3,1 gam.
2.1.3. Hóa chất, sinh phẩm:
Tá dược Freund hoàn toàn (CFA), không hoàn toàn (IFA): hãng Sigma và tự chế. Glutaraldehyde, pepsin, ammonium sulphate, acid clohydric, acid sulfuric, NaOH, toluen, merthiolat: hãng Merk, Đức. Dung dịch đệm PBS: tự chế. NaCl 0,9%: Dược phẩm TW2. Chống đông CPDA1, Heparin.
Môi trường Sabouraud, Thioglycolate, thạch agarose.
2.1.4. Dụng cụ, phương tiện, trang bị:
Laboratory của Đơn vị nghiên cứu HTKN, Trung tâm chống độc Quốc gia, có các điều kiện trang bị kỹ thuật như sau:
- Phòng thí nghiệm thường xuyên ổn định nhiệt độ (lạnh) và vô trùng. - Hốt lạnh vô trùng Telstar (Tây Ban Nha).
- Cân điện 0,01 mg của Heiligenstadt (Đức).
- Máy ly tâm lạnh, tủ lạnh bảo quản sinh phẩm, huyết tương. - pH - Meth của hãng Hana (Italia).
- Nhiệt kế chính xác (Anh).
- Máy lọc Seiz + đĩa lọc Xellulose 0,2 - 0,45µm(Mỹ), - Màng cellulose acetate thẩm tích (Đài Loan).
- Cốc đong, que khuấy thủy tinh, pipet thủy tinh, ống nghiệm,..., - Tủ ấm, tủ sấy, bình cách thủy Bain - marie (Mỹ).
- Hệ thống cung cấp nước cất, điều chỉnh nhiệt độ nước. - Hệ thống lọc vô trùng theo từng công đoạn kỹ thuật.
- Hệ thống sấy hấp và khử trùng dụng cụ. - Hệ thống đóng lọ.
Dụng cụ bắt rắn, lấy nọc, bảo quản nọc chuyên dùng (Mỹ).
Dụng cụ gây mẫn cảm ngựa (Đài Loan).
Dụng cụ lấy máu, truyền máu ngựa chuyên dùng (Đài Loan).
Dụng cụ tách huyết tương, sản xuất khối hồng cầu ngựa.
Dụng cụ kiểm tra chất lượng KN và kiểm định cơ sở.
Máy điện di protein tự động Geni – 0 (Italia)
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu Labo + thực nghiệm trên động vật.
2.2.2. Tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm cần đạt:
Bảng 2.1. Tiêu chuẩn Quốc gia, Dược điển Việt Nam IV, 2009 [9][36]:
TT Tên các chỉ tiêu Tiêu chuẩn cần đạt của HTKN-RCN đa giá
1 An toàn chung Đạt an toàn chung
2 Vô khuẩn Không có vi khuẩn, vi nấm
3 Chí nhiệt tố Không có chất gây sốt
4 Hiệu giá KT/lọ Đạt > 100 LD50/lọ 5ml theo đề cương NC
5 pH 6 - 7
6 Merthiolat ≤ 0,01%
7 Sodium chlorid 0,85 % - 0,9%
8 Nitơ toàn phần ≤ 15 %
Bảng 2.2. Tiêu chuẩn cần đạt, theo WHO guidelines, 2008 [151]:
TT Tên các chỉ tiêu Tiêu chuẩn cần đạt (Tham khảo)
1 An toàn chung Đạt
2 Vô khuẩn Không có vi khuẩn, vi nấm
3 Chí nhiệt tố Không có chất gây sốt
4 Hiệu giá KT/lọ Đạt đăng ký của nhà sản xuất
6 Lượng chất bảo quản Phenol < 2,5 g/l, Cresols < 3,5 g/l
7 Sodium chlorid 0,85 % - 0,9%
8 Nitơ toàn phần ≤ 100 g/l
9 Albumin ≤ 1 %
10 Globulin > 90%
2.2.3. Nội dung nghiên cứu:
2.2.3.1. Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2.
- Chế tạo kháng nguyên nọc RCN đa giá, giảm độc lực, an toàn, hiệu lực. - Gây mẫn cảm ngựa, theo dõi hình thành kháng thể đặc hiệu.
- Lấy máu, thu huyết tương, truyền trả khối hồng cầu.
- Tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2, xác định độ tinh sạch của sản phẩm.
2.2.3.2. Đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm.
- Kiểm định cơ sở, đánh giá tính an toàn và hiệu lực của HTKNR đa giá. - Kiểm định Quốc gia tại Viện kiểm định Quốc gia VX&SPYT, Bộ y tế. - Sơ bộ tính giá thành sản xuất, đánh giá hiệu quả kinh tế, xã hội.
2.2.4. Các phương pháp kỹ thuật nghiên cứu:
2.2.4.1. Tuyển chọn rắn, lấy nọc, bảo quản nọc:
- Chọn rắn cạp nia bắc, nam; lấy nọc, bảo quản nọc theo phương pháp của Trần Kiên, Trịnh Xuân Kiếm và David Warell [21],[23],[24]:
+ Chọn rắn: xác định loài rắn theo hình thái và nanh độc. Rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) có thân mình khúc đen, khúc trắng xen kẽ, khoang trắng hẹp, số lượng khoang nhiều (>40 khoang). Rắn cạp nia nam (Bungarus candidus): thân rắn “khúc đen, khúc trắng”, có ít khoang (tối đa 32 khoang) màu đen nhánh không khép kín, bao quanh lưng đến sát mặt bụng, xen kẽ là các khoang trắng rộng hơn khoang đen. Rắn Bungarus slowinskii: cũng có hình dạng “khúc đen, khúc trắng”, nhưng khúc trắng hẹp, khoang đen rộng,
thân và đầu rắn có khoang trắng hình chữ V. Nanh độc nhỏ, ngắn, sắc nhọn và có rãnh, dễ gãy.
+ Nuôi rắn và lấy nọc rắn: cách ly, kiểm tra loại bỏ rắn ốm, tiến hành lấy nọc. Khi lấy, ép hai bên đầu rắn, cho rắn há miệng để lộ răng độc, đưa ống capile vào hứng nọc, lấy xong nọc từng con, bơm nọc vào lọ vô khuẩn, để khô, giữ ở nhiệt độ 2- 4oC, tránh ánh sáng, đông khô nọc, bảo quản - 20oC.
A B C
Hình 2.1. Ba loại rắn “khúc đen, khúc trắng” có thể gặp tại Việt Nam.