- Dựa trên kết quả ở bảng 3.21, tính LD50 theo công thức của Karber (theo Nguyễn Xuân Phách, Nguyễn Thế Minh, 1995)[27]:
4.1.1.Chế tạo kháng nguyên:
Z: số trung bình tử vong củ a2 nhóm kế cận d: khoảng cách liều lượng giữa các nhóm.
4.1.1.Chế tạo kháng nguyên:
Khâu quan trọng đầu tiên là chế tạo kháng nguyên, đây là chìa khóa thành công của quy trình sản xuất HTKNR. Kháng nguyên phải đảm bảo đã được làm giảm hoặc mất hoàn toàn độc lực nọc rắn, an toàn cho động vật gây mẫn cảm đồng thời có tính sinh miễn dịch mạnh. Tất cả các khâu trong chế tạo kháng nguyên đều nhằm phục vụ mục đích này.
Để chế tạo được kháng nguyên, phải có nguyên liệu là nọc rắn, đảm bảo chất lượng và số lượng. Bảng 3.1 cho thấy, việc tuyển chọn rắn đã đạt yêu cầu: chính xác, lấy đủ số lượng, đảm bảo chất lượng nọc, an toàn tuyệt đối.
Do tính đặc hiệu của nọc rắn theo vùng địa lý, phải lấy được nọc rắn cạp nia ở khắp các vùng miền, đại diện cho quần thể rắn cạp nia trong cả nước, đây là yêu cầu quan trọng, có tác dụng làm tăng tính hiệu lực của HTKN-RCN đa giá sau khi được sản xuất. Ngoài tuyển chọn rắn đúng chủng loài, phải tiến
hành lấy nọc nhiều lần để có đủ số lượng cần thiết. Lượng nọc của rắn cạp nia rất ít so với rắn hổ mang, rắn choàm quoạp, rắn hổ chúa... nên qua sáu lần lấy, số nọc của 276 con rắn cạp nia bắc chỉ được 1,6 gam; của 145 con rắn cạp nia nam chỉ được 1,5 gam, như vậy: rắn cạp nia nam có thể cho nọc nhiều hơn so với mỗi con rắn cạp nia bắc. Lượng nọc của một rắn cạp nia có thể lấy được khoảng từ 4,6 – 11,6 mg. Kết quả này tương tự thông báo của một số tác giả khác, cho rằng số lượng nọc rắn cạp nia mỗi lần cắn vào khoảng 4,6 mg – 18,4 mg [162]. Số lượng nọc rắn cạp nia bằng 1/5 -1/10 các loài rắn khác, đây là điểm khó khăn cho nghiên cứu. Số lượng nọc rắn ở mỗi con liên quan đến nhiều yếu tố: kích thước, trọng lượng rắn, tuổi rắn, rắn đã ăn bao lâu...Tuy vậy, khó có thể biết được trước con rắn sắp lấy nọc có nhiều hay ít nọc. Ngoài đảm bảo đủ về số lượng, phải đảm chất lượng nọc rắn. Nọc phải sạch, không lẫn máu, độc tính nọc và các thành phần được giữ nguyên [20],[21]. Tuân thủ các hướng dẫn của WHO, nhóm nghiên cứu đã mua và thu nhận rắn lấy nọc từ tự nhiên, sử dụng chuồng trại nuôi đúng quy cách theo tập tính loài rắn, nuôi nhốt hàng tháng để loại trừ rắn bệnh...Do nanh độc của rắn cạp nia rất nhỏ, khi lấy nọc phải quan sát rất nhanh, đưa dụng cụ vô trùng đúng vào vị trí nanh độc, tránh xây xước, chảy máu lẫn vào nọc rắn, làm giảm chất lượng nọc. Với các loài rắn độc khác có nanh độc to hơn, khi lấy nọc, có thể cho rắn ngoạm vào một màng polyten mỏng bịt kín miệng ống đựng nọc vô trùng, tẩm sẵn chất sát trùng, để sát trùng nanh độc. Nọc rắn cạp nia sau khi lấy được để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, bảo quản ở nhiệt độ lạnh, sau đó tiến hành đông khô nọc để không làm thay đổi đặc tính kháng nguyên của nọc rắn. Nọc rắn khô có chứa chủ yếu là protein (70 - 90%) và một lượng nhỏ chất vô cơ, polypeptide, nucleotide, carbonhydrates, chất béo và các amin. Các thành phần protein bao gồm: các enzyme và protein không phải enzyme. Nọc rắn đông khô bảo quản ở - 20oC giữ được độc tính nọc 15 – 20 năm, hầu như không thay đổi so với ban đầu.
Việc đảm bảo tuyệt đối an toàn trong quá trình làm việc với rắn và nọc rắn là một đòi hỏi nghiêm ngặt, được tuân thủ ngay từ đầu. Trong thực tế, đã nhiều người bắt rắn, buôn bán rắn, thậm chí là nhà khoa học về rắn - tử vong do bất cẩn. Thí dụ, tiến sĩ Joseph Bruno Slowinski (1963 - 2001), người Mỹ đã chết tại Mianma khi bắt một con rắn cạp nia bắc
tại lưu vực sông Hồng, đó là rắn khoang sông Hồng hay còn gọi là rắn khoang Bungarus slowinki [158]. Trước khi lấy nọc rắn, phải chuẩn bị tốt về sức khỏe, kiến thức về đặc tính loài rắn, hiểu rõ về cấu trúc, vị trí răng độc, cách giữ đầu rắn đuôi rắn, cách phối hợp thao tác khi lấy nọc... Dụng cụ lấy nọc: gậy bắt rắn, túi lưới, bàn lấy nọc, ủng, găng tay... được chuẩn bị đầy đủ. Người lấy nọc luôn tỉnh táo đề phòng rắn cắn trong lúc thao tác kỹ thuật và tuyệt đối không để nọc rắn dính vào tay.
Cho đến nay, do không có cơ sở cung cấp nọc rắn chuẩn Việt Nam, nên việc chủ động tuyển chọn, nuôi và lấy nọc rắn vẫn là vấn đề đặt ra cho người nghiên cứu.
Để sản xuất HTKNR đa giá có kết quả tốt, hiệu lực mạnh, thường sản xuất kháng nguyên lấy từ các loài rắn độc cùng họ (họrắn hổ Elapidae, họ rắn lục Vipridae...), cùng chi (chi Naja, chi Bungarus...). Việc khảo sát sự phân bố, mức độ thường gặp của các loài rắn khác trong chi rắn cạp nia là rất có giá trị, giúp định hướng sản xuất HTKNR đa giá cho những loài rắn nào thường gặp, nguy hiểm nhất. Mặc dù đây không phải là nghiên cứu dịch tễ học với những số liệu thống kê lớn, chỉ là một số khảo sát sơ bộ, số liệu hạn chế, xong cũng đã nói lên được nhiều điều (bảng 3.2).
Thứ nhất, trong các loài rắn khoang chi rắn cạp nia (Bungarus) Việt Nam, rắn cạp nia nam (B.candidus), rắn cạp nia bắc (B.multicinctus) và rắn khoang sông Hồng (B.slowinkii) là ba loài rắn “khúc đen, khúc trắng” có trong tự nhiên. Khắp Việt Nam, khi hỏi về rắn khúc đen khúc trắng rất nhiều người biết. Việc dễ dàng sưu tầm và tuyển chọn những loài rắn này cho nghiên cứu là bằng chứng cho thấy sự thường gặp của chúng. Người ta thường khó phân biệt các loài rắn nói trên ngoài việc chỉ xác định chúng là “rắn khúc đen khúc trắng” mà thôi. Thứ hai, chỉ có hai loài rắn cạp nia bắc và rắn cạp nia nam là thường gặp trong ba loài rắn đen-trắng trên. Với rắn khoang sông Hồng (Bungarus slowinskii), do dễ nhầm với rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus), khi tuyển chọn rắn chúng tôi đã lưu ý để loại khỏi nhóm nghiên cứu. Loài này có khúc đen, khúc trắng với khoang trắng hẹp hơn khoang đen, đầu và thân có vạch trắng hình chữ V là điểm chủ yếu phân biệt với rắn cạp nia bắc, nam [175]. Tuy nhiên, trong thời gian khảo sát, chúng tôi không gặp loài này trong quá trình nghiên cứu.
nia nam (Bungarus candidus). Ngược lại, khi tuyển chọn rắn cạp nia ở các tỉnh miền Nam, chúng tôi không gặp rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus). Kết quả của chúng tôi phù hợp với thông tin trong các nghiên cứu của Hà Trần Hưng, Nguyễn Thị Dụ, Jonas Höjer, Trịnh Xuân Kiếm 2009 - 2010 [71],[72] về rắn cạp nia bắc và các nghiên cứu của Trịnh Kim Ảnh, Trịnh Xuân Kiếm (2001) [6], Trịnh Xuân Kiếm, Lê Khắc Quyến, Trịnh Xuân Long, David A. Warrell (2010) [88] về rắn cạp nia nam. Các loài rắn cạp nong (Bungarus fasciatus), rắn cạp nong đầu đỏ (Bungarus flavicep) có nọc độc song hiếm gặp. Kết quả sơ bộ khảo sát về phân bố các loài rắn trong chi rắn cạp nia cần được tiếp tục bổ sung. Kết quả này phù hợp với thông báo của các tác giả Trần Kiên, Nguyễn Quốc Thắng (1995)[24], Nguyễn Quang Trường, Nguyễn Thiên Tạo (2011)[39].
Mặc dù tiêm nọc rắn chưa biến đổi hoặc chưa tác động để làm mất độc lực có thể tạo ra kháng thể đặc hiệu tốt hơn ở động vật gây mẫn cảm nhưng lại tạo ra các nghiêm hiểm cho động vật, điều này khiến việc sử dụng nọc nguyên chất đã không được khuyến khích. Từ năm 1894, nhiều phương pháp chuẩn bị nọc độc được đề xuất làm giảm độc tính và bảo đảm tính chất kháng nguyên. Giải độc có thể thu được kết quả với các phương pháp khác nhau: xử lý bằng nhiệt, hypochlorite, xà phòng, hỗn hợp với lipoids, hydrogen peroxide, bức xạ ion hóa và một số phương pháp khác [101]. Tuy nhiên, không có phương pháp nào trong số này có hiệu quả hoàn hảo. Phức hợp của nọc độc và formalin tạo thành anavenin là phương pháp thú vị nhất và vẫn được sử dụng cho đến ngày hôm nay, điển hình như aldehyde (glutaraldehyde) [70]. Tannin cũng đã được sử dụng nhưng hạn chế của formalin hoặc tannin là có thể được đào thải ra khỏi anavenin (Chippaux JP, Goiffon M, 1998) [55]. Kháng nguyên chế tạo đạt thử nghiệm về an toàn chung (bảng 3.4), không có chất gây sốt (bảng 3.5) và vô khuẩn (bảng 3.6). Thử nghiệm tiến hành trên các động vật nghiên cứu nhạy cảm cao với độc tố, chất gây sốt là chuột lang Cobaye, thỏ và được cấy khuẩn cấy nấm trong các môi trường và nhiệt độ tối thích. Đây là yêu cầu bắt buộc trước khi tiến hành chính thức gây mẫn cảm cho ngựa sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn. Với loại độc tố nọc rắn có độc lực rất mạnh với sinap thần kinh - cơ như nọc rắn cạp nia, chế tạo kháng nguyên nếu không an toàn, có thể gây chết ngựa, gây tổn thất kinh tế, mất thời gian và tốn kém cho nghiên cứu. Chúng tôi đã sử dụng liều 1ml/100g
cân nặng, tức 110 µg/gam (bảng 3.3). Liều này cao gấp 733 lần LD50 của rắn cạp nia bắc (0,15 µg/gam chuột, theo Steven D. et al.,1999) [131] và cao gấp 1100 lần LD50 rắn cạp nia nam (0,1 µg/gam chuột, theo Tan N.H et al., 2004) [135]. Như vậy, nếu không khử độc, chuột thí nghiệm chắc chắn tử vong. - Theo Dược điển Việt Nam IV, 2009 [9] thử nghiệm an toàn có thể dùng tối đa dưới 5 ml sinh phẩm tiêm phúc mạc chuột lang, ở nghiên cứu này, lượng kháng nguyên sử dụng nhiều nhất là 2,5ml.
Có nhiều phương pháp khử độc, bất hoạt độc tính nọc rắn nhưng chúng tôi chọn phương pháp dùng glutaraldehyde (WHO, 2008) [151] phương pháp này được Trịnh Xuân Kiếm bổ sung và sử dụng thường xuyên trong khử độc nọc rắn hổ mang, hổ đất, hổ chúa, choàm quạp... cho kết quả tốt, làm mất độc tính nọc mà vẫn giữ nguyên được tính kháng nguyên [21],[23]. Phương pháp này được nhiều tác giả sử dụng (Huang R.J., et al., 1986
[76], Rogero J.R., Nasimento N., 1995[122]). Nọc rắn cạp nia sau quá trình khử độc với glutaraldehyde, vi khuẩn đã bị tiêu diệt, nếu còn cũng bị loại bỏ khi lọc vô khuẩn với màng lọc celluloze axetat 0,2 µm. Toàn bộ quá trình chế tạo kháng nguyên: lấy nọc, khử độc nọc, tiến hành ly tâm, bỏ cặn, thu dung dịch kháng nguyên, lọc vô trùng, chiết vào các lọ nhỏ, đóng nắp lọ... được tuân thủ chặt chẽ nguyên tắc vô khuẩn. Các dụng cụ lấy nọc và chế tạo kháng nguyên được sấy hấp tiệt trùng; khi chiết dung dịch kháng nguyên vào các lọ nhỏ, đã khử khuẩn nút lọ bằng nhiệt đèn cồn; các thao tác vô khuẩn được thực hiện trong box vô trùng... Các thử nghiệm xác định kháng nguyên an toàn không độc tố, vô khuẩn, không có chất gây sốt, đảm bảo độ tinh khiết, giúp ngựa không bị nhiễm trùng, bị sốt khi gây mẫn cảm, nhất là các tháng cuối gây mẫn cảm, sử dụng số lượng kháng nguyên lớn và nhiều điểm tiêm.
Chí nhiệt tố là sản phẩm chuyển hóa do các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc, nấm men, virus, sinh ra trong quá trình sống của chúng và xác chết của các vi sinh vật này, gây phản ứng sốt khi tiêm (Nguyễn Đăng Hòa, 2006) [17]. Đạt tiêu chuẩn không có chất gây sốt, vô khuẩn cũng chứng tỏ quy trình kỹ thuật được thực hiện trong điều kiện tốt.So với LD50 của rắn cạp nia bắc là 0,15µg/gam chuột (Steven D. et al.,1999) [131] và rắn cạp nia nam
giá nếu không khử độc sẽ cao gấp 73 lần so với LD50 của nọc rắn cạp nia bắc và 110 lần so với LD50 của nọc rắn cạp nia nam (tính toán tương tự phần 3.1.1.4 ở trên).
Một yêu cầu quan trọng thứ hai của chế tạo kháng nguyên nọc rắn cạp nia đa giá là bảo đảm giữ được nguyên vẹn tính kháng nguyên của nọc độc cả hai loài rắn cạp nia bắc và nam. Đảm bảo được điều này sẽ quyết định sự thành công của quy trình sản xuất HTKN- RCN đa giá, giúp HTKNR sản xuất ra có tính đặc hiệu cao, khi sử dụng có thể trung hòa hiệu quả, nhanh chóng các độc tố nọc nguy hiểm trong cơ thể nạn nhân.
Thực tế kết quả quá trình gây mẫn cảm, theo dõi đáp ứng miễn dịch đã chứng minh một lần nữa cho sự thành công trong đảm bảo tính sinh miễn dịch của kháng nguyên trong chế tạo kháng nguyên giảm độc lực.