- Dựa trên kết quả ở bảng 3.21, tính LD50 theo công thức của Karber (theo Nguyễn Xuân Phách, Nguyễn Thế Minh, 1995)[27]:
Z: số trung bình tử vong củ a2 nhóm kế cận d: khoảng cách liều lượng giữa các nhóm.
4.1.4. Kỹ thuật tinh chế HTKN-RCN đạt chất lượng cao:
Trước năm 1992, hệ thống tiêu chuẩn chất lượng thuốc có 4 cấp: tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam (TCVN), tiêu chuẩn ngành (TCN), tiêu chuẩn địa phương (TCV), tiêu chuẩn cơ sở (TC). Hiện nay chỉ còn hai cấp tiêu chuẩn là: tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam và tiêu chuẩn cơ sở. Tiêu chuẩn cơ sở do cơ sở sản xuất biên soạn đối với chế phẩm mình sản xuất (Hoàng Ngọc Hùng, 2005) [18]. Để tinh chế HTKN-RCN đạt chất lượng tốt, ngoài bám sát tiêu chuẩn quy định của Dược điển Việt Nam [36], phải có quy định chặt chẽ về chất lượng, bảo đảm nguồn huyết tương sản xuất có chất lượng (vô khuẩn, hiệu giá cao...), chuẩn độ acid, base chính xác, duy trì nhiệt độ tốt, xác định pH đúng, tính đúng và đủ số lượng ammonium sulphate theo đúng hàm lượng quy định, lọc giấy lọc Whattman vô khuẩn, thẩm tích cẩn thận với nước cất, lọc với máy lọc Seiz có đĩa lọc đúng tiêu chuẩn, đóng lọ và bảo quản đúng quy định về nhiệt độ [3]. Tất cả các khâu này của quy trình tinh chế đều cần quản lý chất lượng chặt chẽ.
Về kỹ thuật, hiện thế giới đang sử dụng cả ba loại kỹ thuật tinh chế IgG, Fab và F(ab')2. Cả ba phương pháp đều sử dụng nguyên liệu ban đầu như nhau. Các kỹ thuật đều nhằm loại bỏ mọi thành phần phi kháng thể, cô đặc phần kháng thể đặc hiệu; điểm khác biệt là sản phẩm cuối cùng chứa phân tử kháng thể IgG nguyên vẹn hay IgG đã được cắt, tách từng phần bằng pepsin, hoặc papain. Bản chất kháng thể cuối cùng sẽ quyết định tính an toàn, hiệu lực và giá thành của sản phẩm. Nhiều trung tâm khoa học trên thế giới đã nghiên cứu vấn đề này suốt nhiều thập kỷ, từ đó mỗi trung tâm lựa chọn qui trình kỹ thuật phù hợp yêu cầu của mình. Thí dụ: Trung tâm sản xuất HTKNR Nam Phi, Ấn Độ… chế tạo HTKNR IgG; công ty Protherics (Anh - Úc - Mỹ) sản xuất HTKNR Fab (Karlson., et al 2009)[84],[120]. Hầu hết các nước đang
phát triển đều sử dụng qui trình kỹ thuật chế tạo HTKNR F(ab')2: Viện Common Serum Laboratories-CSL (Australia), viện Butantan (Brazil) viện Queen Saovabha (Thailand), Trung tâm kiểm tra bệnh tật - CDC (Đài Loan),...Chúng tôi đã lựa chọn tinh chế HTKN-RCN dạng F(ab')2. Dạng HTKNR này an toàn hơn cho người bệnh, hiệu quả trung hòa độc tố nọc rắn rất tốt do ammonium sulfate gây tủa protein nhưng không làm biến đổi tính chất của chúng, thời gian bán hủy thuốc tương đối chậm, đủ thời gian trung hòa độc tố nọc rắn cạp nia, phản ứng huyết thanh thấp (<15%) (bảng 4.1).
Bảng 4.1: So sánh đặc điểm 3 loại HTKNR IgG, F(ab')2 và Fab.
Đặc điểm Loại HTKNR
IgG F(ab')2 Fab
Thời gian phân phối/cơ thể (h) > 3 3 1
Thời gian loại trừ khỏi cơ thể (h) 100 60 10
Gắn vào mô cơ thể Mạnh Vừa yếu
Hoạt hóa bổ thể Có Không Không
Đường loại trừ khỏi cơ thể Mô miễn dịch Mô miễn dịch Thận Phản ứng không mong muốn (%) >80 <15 <10
Giá thành (USD/lọ) 40 70 1.200
Bảng 4.1 cho thấy, HTKNR F(ab')2 có thời gian phân phối thuốc chậm hơn so với HTKNR Fab (3 giờ và 1 giờ), song điều đó không ảnh hưởng đến cứu chữa nạn nhân vì có máy thở hỗ trợ trong khoảng thời gian thuốc chưa được phân phối khắp cơ thể. Giá thành HTKN-RCN F(ab')2 không cao
Mặt khác, HTKNR Fab có thời gian phân phối thuốc nhanh nhưng thời gian thải loại khỏi cơ thể cũng nhanh, chỉ khoảng 10 giờ, giá thành lại rất đắt so với HTKNR dạng IgG và F(ab')2; do vậy, HTKNR Fab không phù hợp với các nước đang phát triển như Việt Nam. HTKNR IgG tác dụng trung hòa nọc độc mạnh, giá thành rẻ nhưng phản ứng huyết thanh cao trên 80%, nên không được lựa chọn để sản xuất sản phẩm này [38],[130].Trong sản xuất HTKNR, việc lựa chọn quy trình tinh chế phù hợp được cân nhắc rất sớm, trước khi bắt tay vào chế tạo kháng nguyên nọc rắn. Sản xuất bằng kỹ thuật gì tinh chế được phần F(ab’)2 đặc hiệu kháng nọc rắn với tỷ lệ cao nhất, tinh sạch nhất là điều cực kỳ quan trọng.
Theo tiêu chuẩn Quốc gia, Dược điển Việt Nam III, IV đề ra ban đầu và tiêu chuẩn của WHO về HTKNR (WHO guidelines, 2008), ngoài việc thiết kế mục tiêu là HTKNR có chứa nhiều nhất F(ab’)2, cần loại bỏ hầu hết những chất không cần thiết của protein ngựa (albumin, globulin không cần thiết), chất bảo quản (phải trong giới hạn cho phép), ammonium sulfate; vi khuẩn, vi nấm, chí nhiệt tố và phải có đủ các điều kiện lý hóa cần thiết của HTKNR như pH trung tính, áp lực thẩm thấu đẳng trương, đảm bảo nồng độ chất bảo quản (thiomersan) ở dưới hàm lượng cho phép...vì vậy, tinh chế huyết tương chứa kháng thể kháng nọc rắn cạp nia đa giá (bắc + nam) thành HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 là một quy trình rất quan trọng, ảnh hưởng quyết định đến chất lượng cuối cùng của sản phẩm. Quy trình đòi hỏi phải được thực hiện rất chặt chẽ, chính xác theo các tiêu chuẩn nghiêm ngặt của sản xuất.
Việc đầu tiên của công đoạn tinh chế HTKN-RCN F(ab’)2 là cắt Fc của IgG có trong huyết tương nguyên liệu bằng pepsin. Phân tử IgG nguyên vẹn có mảnh Fc, là nguyên nhân của các phản ứng không mong muốn trên lâm sàng, nhất là shock phản vệ. Fc mang thụ thể gắn các tế bào mastocyte, bạch cầu ưa kiềm, đó là kho chứa các chất trung gian hóa học histamin, serotonin,
bradykinin... gây phản vệ, phản ứng nguy hiểm nhất trong huyết thanh trị liệu. Pepsin có bản chất là enzyme tiêu protein (protease), thành viên của họ men aspartate protease. Pepsinogen là tiền chất của pepsin, do tế bào niêm mạc dạ dày tiết ra để cắt phân tử protein có trong thức ăn thành peptides. Năm 1836, Theodor Schwann đã phát hiện ra pepsin, và đặt tên “pepsin” từ chữ gốc tiếng Hy lạp “pepsis”, nghĩa là tiêu hóa (peptein: to digest). Năm 1929, pepsin đã là một trong những enzyme đầu tiên được John H. Northrop kết tinh. Cùng với hai enzyme đồng hành: chymotrypsin và trypsin, pepsin vừa có chức năng chuyên biệt, vừa hợp tác với hai enzyme đồng hành để tiêu huỷ protein của thức ăn. Pepsin hoạt động tối ưu ở môi trường acid (pH 2 - 3,2)
(Morais V., Massaldi H., 2005)[103], cùng papain là hai loại enzyme được sử dụng rộng rãi và hiệu quả nhất để nghiên cứu cấu trúc của phân tử kháng thể bằng cách cắt rời phân tử kháng thể ở vị trí aminoacid đặc hiệu. Đặc biệt hơn nữa, các mảnh peptides đã cắt rời vẫn còn nguyên chức năng sinh học của nó (Nisini R., Le Moli S., et al., 1989), [108].
Papain cắt phân tử kháng thể IgG tại vị trí amino acid tận cùng của cầu nối disulfide, tạo thành ba mảnh (fragments), hai mảnh có hoạt tính “gắn” KN, được gọi là mảnh Fab (Fragment antigen biding), vì có một “tay” của phân tử kháng thể, gồm chuỗi nhẹ ghép đôi với vùng lãnh địa (domains) VH và CH1 của chuỗi nặng. Mảnh còn lại không có hoạt tính gắn KN, nhưng có thể kết tinh, được gọi là Fc (Fragment crystallize). Trong khi đó, pepsin cũng tác dụng tại vùng tưng tự như papain, nhưng ở vị trí carboxyl tận cùng của cầu nối disulfide, tạo ra mảnh F(ab)2, có cả hai “tay” của phân tử IgG và mảnh Fc. Fc cặp đôi với CH2 và CH3 của chuỗi nặng và là phần của kháng thể có chức năng tương tác với tế bào và phân tử khác (effector molecules), là nguyên nhân của các phản ứng không mong muốn khi điều trị kháng huyết thanh, trong đó nguy hiểm nhất là shock phản vệ. Bằng kỹ thuật sử dụng
pepsin cắt bỏ Fc, chỉ còn lại mảnh F(ab)2 có đặc tính “gắn” kháng nguyên giống hệt kháng thể gốc nguyên vẹn, nhưng lại không có khả năng tương tác với bất cứ phân tử hoặc tế bào nào; do vậy F(ab)2 có tiềm năng ứng dụng điều trị rất lớn.
Theo bảng 3.12, lượng huyết tương đưa vào sản xuất lần đầu (lô I) của hai ngựa là 3,6 lit. Sau khi cắt Fc bằng pepsin, tủa các thành phần không chứa kháng thể kháng nọc RCN bằng ammonium sulfate 14%, thu dịch lọc chứa kháng thể kháng nọc RCN đa giá F(ab’)2, được 2,9 lít. Tỷ lệ thu lại dịch lọc có KT là 80,6%. Trong lần sản xuất thứ hai (lô II), đưa vào tinh chế 6,4 lít huyết tương, thu được 5,1 lít dịch lọc chứa kháng thể, tỷ lệ 80,3%. Như vậy, với phương pháp như nhau, kết quả thu được tương tự. Tỷ lệ thu lại huyết tương giàu F(ab’)2 với hai lần tinh chế là 80,4%. Tỷ lệ này cho thấy, trong ≈ 20% thể tích loại bỏ có chứa các thành phần protein không phải F(ab’)2. Đây là sự cần thiết đầu tiên cho tinh sạch sản phẩm.
Tủa với ammonium sulfate có lợi điểm giữ được nguyên tính chất của các mảnh F(ab’)2 nhưng hiệu xuất kém hơn so với các kỹ thuật tinh chế khác như Sắc ký trao đổi ion (Ion-exchange chromatography) và kỹ thuật Sắc ký ái lực (Affinity chromatography). Sắc ký trao đổi iondựa trên sự tích điện khác nhau giữa HTKNR và các chất tạp nhiễm. Cột trao đổi anion DEAE, QAE gels hoặc màng như màng vi xốp cellulose, ở pH trung tính sẽ hấp phụ chất nhiễm bẩn là protein. Cột trao đổi cation như carboxymethyl gel hoặc sulfopropyl khi tinh chế HTKNR IgG hoặc F(ab’)2 , ở pH= 4,5 sẽ bám dính HTKNR trong khi chất nhiễm bẩn protein bị loại bỏ qua cột. Kỹ thuật sắc ký áp dụng theo GMP, có thể vệ sinh, xử lý, bảo quản sử dụng nhiều lần, nhưng phải được kiểm tra, đề phòng nhiễm bẩn từ lô HTKNR này sang lô HTKNR khác. Sắc ký ái lực sử dụng nọc cố định trên cột để gắn các phân tử globulin hoặc mảnh của nó khi cho dung dịch HTKNR chảy qua. Tuy nhiên, cột
thường bị kém chất lượng khá nhanh, cần phải rửa, vệ sinh, xử lý rất cẩn thận, bảo quản trong điều kiện thích hợp. Kỹ thuật này phải đảm bảo chắc chắn chất bẩn đã hoàn toàn bị loại bỏ theo qui trình nghiêm ngặt, không ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm. Kỹ thuật ái lực có thể ảnh hưởng sự hồi phục của kháng thể ái lực mạnh, sẽ làm mất hoặc hủy hoại kháng thể. Tuy nhiên, nếu sử dụng bổ sung thêm hai kỹ thuật này sau tinh chế, chất lượng HTKNR không tăng thêm đáng kể, nguy cơ nhiễm bẩn cao, và đặc biệt sẽ đẩy giá thành HTKNR lên cao nhiều lần ( > 800 USD/lọ), vượt quá xa khả năng chấp nhận của nạn nhân bị rắn cắn nghèo khó.
Kỹ thuật tủa protein bằng ammoni sulfat đã được biết đến từ rất lâu. Việc thu nhận và tinh sạch protein đều dựa trên những tính chất hóa lý của protein, như: độ tích điện, kích thước phân tử, độ hòa tan...của protein cần chiết xuất. Nhiều protein còn liên kết với các phân tử sinh học khác nên việc chiết xuất các protein này còn phụ thuộc vào bản chất của các liên kết. Muốn thu nhận được các protein nguyên thể tức là protein có tất cả tính chất tự nhiên đặc trưng của nó, cần sử dụng các biện pháp khác nhau như: nhiệt độ, pH, dùng chất hóa học như muối: (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4.., các dung môi hữu cơ như ethanol, acetone...vv. Trong các phương pháp đó, dùng muối ammonium sulfate tách protein đã và đang được sử dụng phổ biến và hiệu quả nhất. Thêm muối vào dung dịch protein là làm giảm lớp hydrate hóa. Lớp hydrate bao quanh phân tử protein giảm đi sẽ bộc lộ nhóm “kỵ nước”, lực hút tĩnh điện tăng lên, protein bị kết tủa. Ammonium sulfate có khả năng hòa tan rất cao tới nồng độ 4M, trong khi ở nồng độ 3,2M hầu hết các loại protein đều đã bị tủa. Tăng nồng độ ammonium sulfate sẽ làm tăng sự tranh chấp phân tử nước, protein càng nhanh chóng kết tủa. Điều chỉnh nồng độ ammonium sulfate tăng dần bằng cách thêm trực tiếp muối vào dung dịch, vừa tách chọn lọc từng loại protein, vừa kiểm soát được thể tích dung dịch. Chỉ sau 30-60
phút hòa tan ammonium sulfate theo từng nồng độ chọn lọc, toàn bộ protein tương ứng đã bị tủa. Khi tái hòa tan hạt protein kết tủa trong đệm mới, cấu trúc phân tử và hoạt tính sinh học của protein vẫn được giữ nguyên. Một số muối cùng tủa theo protein, cần phải loại bỏ bằng thẩm tích. Như vậy, dung dịch protein thành phẩm vừa tinh sạch vừa được cô đặc, vẫn giữ nguyên được chức năng sinh học của kháng thể. Tất nhiên, ngoài nồng độ và tính chất của ammonium sulfate, tủa protein còn phụ thuộc vào pH và nhiệt độ của dung môi. Ở pH = 4,2 và nhiệt độ 20oC, với nồng độ ammonium sulfate = 14%, mọi thành phần protein không phải F(ab’)2, kể cả Fc và lipid đều bị tủa và được loại bỏ, dịch lọc chứa F(ab')2 được thu lại trong dịch lọc huyết tương [3], [30],[37]. Khi điều chỉnh pH dịch lọc lên 6,8 ở 20oC, rồi thêm ammonium sulfate tới 22%, trộn đều, sau 60 phút sẽ tủa toàn bộ kháng thể F(ab')2 cùng với muối ammonium sulfate. Nhiều tác giả cũng giải thích tương tự về kỹ thuật và đạt kết quả tinh chế tốt (Jones R.G.A,, Landon J., 2003) [80].
Theo bảng 3.13, ở lô I, với 2,9 lít dịch lọc chứa KT đưa vào tinh chế, sau khi thêm ammonium sulfate tới 22%, thu được 210 gam tủa kháng thể F(ab')2. Trong lần sản xuất thứ 2 (lô II), với 5,1 lít dịch lọc giàu kháng thể, tủa tiếp với muối ammonium sulfate 22%, thu được 495 gam tủa giàu kháng thể. Với tỷ lệ thu lại lượng tủa so với huyết tương sản xuất của lần II, giống như lần I cho thấy: phương pháp như nhau thì kết quả giống nhau.
Tiếp tục công đoạn tinh chế HTKN-RCN F(ab’)2, cần phải tiến hành thẩm tích loại bỏ ammonium sulfate khỏi tủa giàu F(ab’)2 và lọc với máy lọc Seiz, đĩa lọc cellulose kích thước lỗ lọc 0.2 µm, tạo HTKN-RCN F(ab')2 dạng bán thành phẩm hoàn toàn vô trùng. Bảng 3.14 cho thấy: Lô I, sau khi thẩm tích 190 ml dịch tủa giàu kháng thể kháng nọc RCN F(ab’)2 và lọc, thu được 165 ml HTKN-RCN bán thành phẩm (chưa kiểm định cơ sở). Thẩm tích Lô II, với 510 ml sau thẩm tích và lọc, thu được 485 ml. Cả hai lần thu được 650
ml HTKN-RCN F(ab’)2 bán thành phẩm. Tỷ lệ hao hụt như nhau, 25 ml/lần, cho thấy, lọc nhiều huyết tương một lần tiết kiệm hơn. Như ở đây, một lần lọc sẽ giảm được 25 ml HTKN-RCN dạng F(ab’)2, tương đương 5 lọ, mỗi lọ có giá sản xuất chừng 70 USD (bảng 3.24, phần Phụ lục), cũng là giảm một khoản chi phí đáng kể. Tỷ lệ này vẫn còn cao, do dùng máy lọc Seiz, kiểu cũ. Nếu lọc với máy mới, ngoài chất lượng tốt hơn, thời gian lọc nhanh hơn, còn tiết kiệm được nhiều HTKNR hơn. Bảng 3.15 chỉ ra một số hóa chất chính đã sử dụng tinh chế HTKN-RCN F(ab’)2. Kết hợp với bảng phụ lục 4, thấy số lượng kinh phí cho công đoạn tinh chế không lớn. Sản xuất HTKN-RCN loạt đầu tiên, tiến hành trong khoảng 14 -16 tháng (tuyển chọn rắn và chế tạo KN 1 - 2 tháng, miễn dịch ngựa trong 9 tháng, sản xuất và tinh chế HTKN 1 tháng, kiểm định cơ sở và kiểm định quốc gia 1-2 tháng). Chi phí ≈ 175 triệu đồng thu được 650 ml HTKN-RCN sản phẩm, tương đương 269.000/ml. Nếu đóng lọ 5 ml, giá thành của 1 lọ HTKN- RCN khoảng 1.346.000 VNĐ/lọ. Những lần sản xuất sau sẽ có giá thành rẻ hơn do chi phí trước không phải tính đến (chi phi mua ngựa giống, chuồng trại, dụng cụ, trang thiết bị chuyên dùng đã mua từ trước). Đây là một kỹ thuật dễ thực hiện, quy mô nhỏ, phục vụ nhu cầu của đối tượng BN không lớn. Bảng 3.16 cho thấy đã tinh chế được 650 ml HTKN-RCN F(ab’)2 dạng bán thành phẩm và sau khi kiểm định cơ sở đạt yêu cầu, đóng lọ 5 ml, được 130 lọ HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 thành phẩm, đạt yêu cầu số thành phẩm theo đề cương nghiên cứu đặt ra (100 - 200 lọ). Liều lượng ammonium sulfate mà Guidlolin R.G, Marcelino R.M, et al.,
(2010) [69] sử dụng là 29%, cao hơn chúng tôi.
Theo bảng 3.17, kết quả định lượng protein, albumin, globulin, IgG, IgM, tỷ lệ A/G huyết thanh ngựa và HTKN-RCN đa giá F(ab’)2cho thấy: thành phần chủ yếu của HTKN-RCN đa giá F(ab’)2là globulin, chiếm 97,2%. Trong số 48,4 g/l globulin (100%), các globulin IgG, IgA, IgM có số lượng là
2,14g/l, chỉ chiếm 4,4%. Như vậy 95,6% còn lại là mảnh F(ab’)2. Mảnh