3. NỘI DUN GỜ NGUYÊN LIỆU Ờ PHƯƠNG PHÁP VÀ đỊA đIỂM NGHIÊN CỨU
3.3.2 Phương pháp lấy mẫu và làm xét nghiệm vi khuẩn
3.3.2.1 Phương pháp kiểm tra vi khuẩn có trong nước sử dụng cho giết mổ.
Sử dụng phương pháp lấy mẫu và xét nghiệm vi khuẫn nguồn nước theo quy trình của Viện y học lao ựộng, vệ sinh môi trường (2002) và tiêu chuẩn Việt Nam 1686 (TCVN, 1978).
* Phương pháp lấy mẫu
- Lấy mẫu nước máy tại vòi của nước máy: Cần mở nước chảy hết cỡ trong vòi 2-3 phút. đóng vòi và khửu khuẩn kỹ vòi nước bằng nhiệt ựộ bông cồn. Mở vòi nước cho chảy mạnh 1 Ờ 2 phút rồi ựiều chỉnh chảy vừa ựủ ựể lấy mẩu vào chai nút mài 500ml ựã ựược hấp, sấy tiệt trùng. Thao tác lấy mẫu cần phải ựảm bảo vô trùng, Mẫu phải bảo quản lạnh sau ựó chuyển về phòng thắ nghiệm.
- Lấy mẫu tại bể chứa: Khử trùng giá cây Inox bằng cồn 700C, sau ựó ựặt chai nước mài 500ml (ựã ựược hấp, sấy tiệt trùng) có buộc dây ơ nắp vào cây giá treo. Thả chai lấy mẫu xuống ựộ sâu khoảng 0,3 Ờ 0,5 m, dật dây nút mài ựể nước chảy vào ựầy chai thì kéo lên, nghiêng cây giá ựổ bớt phần nước trong trai mẫu, ựạy nút mài và ghi nhãn lấy mẫu. Bao gói, bảo quản lạnh và ựưa mẫu về phòng thắ nghiệm.
Sử dụng phương pháp cấy láng ựể xác ựịnh vi khuẩn. Mẫu nước ựược pha loãng ở các ựậm ựộ khác nhau: 10-1, 10-2, 10-3 . Tùy theo ựộ sạch bẩn ựể quyết ựịnh ựộ pha loãng. Sử dụng pipet vô trùng chuyển 1ml nước mẫu pha loãng và giữa ựĩa Petri, mỗi ựộ pha loãng lấy vào hai ựĩa Petri, mỗi ựộ pha loãng cấy vào hai ựĩa. Rót vào mỗi ựộ pha loãng 12 Ờ 15 ml môi trường thạch thường 450C, xoay tròn ựĩa theo chiều kim ựồng hồ, sau ựó xoay ngược lại ựể trộn ựều môi trường với mẫu nước ựiều tra. để ựĩa thạch ựông tự nhiên, úp ựĩa Petri chuyển vào tủ ấm 370C trong 24 giờ.
để số khuẩn lạc mọc trên bề mặt ựĩa thạch. để tránh nhầm lẫn cần ựưa ựĩa thạch lê giá kắnh chia ô ựể ựếm. Nếu vượt quá 300 khuẩn lạc/ ựĩa Petri thì loại bỏ và mẫu cần ựược pha loãng tiếp.
đọc kết quả tắnh theo công thức
N(vk/1ml) = A + 10B +100C +1000D n
Trong ựó: N: Số lượng vi khuẩn trong 1ml nước
A: Số lượng khuẩn lạc trong 1ml nước nguyên không pha loãng B: Số khuẩn lạc trong 1ml nước ở ựộ pha loãng 10-1
C: Số khuẩn lạc trong 1ml nước ở ựộ pha loãng 10-2 D: Số khuẩn lạc trong 1ml nước ở ựộ pha loãng 10-3 n: độ ựậm pha loãng
* Phương pháp xác ựịnh vi khuẩn E.coli
- Sử dụng phương pháp lên men nhiều ống và tắnh kết quả số lượng
E.coli bằng cách tra bảng tìm số gần ựúng MPN (Most Probable Number). - Mẫu pha ở các ựộ pha ở các ựộ khác nhau: 10-1, 10-2, 10-3,... Tùy theo ựộ sạch bẩn. Thông thường một mẫu nuôi cấy ở 3 ựậm ựộ liên tiếp.
tủ ấp 420C trong 24 giờ. Sau ựó các ống môi trường ựã chuyển mầu từ hồng ựỏ sang mầu vàng và sinh hơi ống Durham thì ria cấy chuyển sang thạch Endo ựể tủ ấm 420C trong 24 giờ.
Trên môi trường Endo khuẩn lạc xuất hiện màu ánh kim, ựó có thể là khuẩn lạc E.coli có nguồn gốc từ phân. Làm phản ứng IMVIC ựể xác ựịnh vi khuẩn.
Tắnh kết quả: Ghi chép số lượng các ống dương tắnh, tra bảng MPN tắnh số E.coli trong một lắt nước (Coli index).
3.3.2.2. Phương pháp kiểm tra vi sinh vật có trong thịt
*Phương pháp xác ựịnh tổng số vi khuẩn hiếu khắ trong mẫu thịt.
Xác ựịnh tổng số vi khuẩn hiếu khắ (TCVN Ờ 5667, 1992); Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu (TCVN Ờ 4833 Ờ 1 Ờ 2, 2002).
- Nguyên lý: Trên môi trường thạnh thường, ở ựiều kiện hiếu khắ, ở 370C, trong 24 giờ, mỗi khuẫn lạc phát triển riêng rẽ là một ựiểm xuất phát của vi khuẩn. đếm số khuẩn lạc trên ựĩa thạch chắnh là số vi khuẩn chứa trong mẫu phâm tắch.
- Chuẩn bị mẫu: Cân 25g thịt (loại bỏ mỡ, gân, bạc nhạc) cho vào túi P.E chuyên dụng vô trùng, bổ sung thêm 225 ml dung dịch ựệm Peptone. đồng nhất mẫu bằng máy Stomacher trong 1 phút. Hỗn dịch thu ựược có tỷ lệ mẫu pha loãng 10-1, từ hỗn dịch này có thể pha loãng 10-2, 10-3 và các bậc pha loãng cao hơn. Tùy theo mức ựộ ựánh giá ô nhiễm ựể xác ựịnh mức pha loãng.
- Phương pháp nuôi cấy: Với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ắt nhất 3 ựậm ựộ, mỗi ựậm ựộ cấy vào 2 ựĩa thạch riêng. Lấy 0,1 ml dung dịch ựồng nhất mẫu pha loãng ở những ựậm ựộ khác nhau ựể chuyển vào ựĩa Petri. đổ vào mỗi ựĩa 12 Ờ 15 ml môi trường thạch PCA (Plate Count Agar) hòa tan (ựã ựược hấp vô khuẩn, ựể nguội 450C), trội ựều bằng cách xoay nhẹ ựĩa 1 Ờ 2 vòng theo chiều kim ựồng hồ và ngực lại. để ựĩa thạch ựông tự nhiên trên mặt
phẳng nằm ngang, sau ựó lật ngược ựĩa chuyển vào tủ ấm 370C, trong 24 giờ ựọc kết quả.
- Tắnh kết quả: đếm tất cả khuẩn lạc xuất hiện trên ựĩa thạch. để tránh nhầm lẫn cần ựưa ựĩa thach lên giá kắnh chia ô ựể ựếm. Nếu vượt quá 300 khuẩn lạc/ựĩa Petri thì loại bỏ và mẫu cần ựược pha loãng tiếp.
Tổng số vi khuẩn hiếu khắ trong 1g thịt ựược tắnh theo công thức sau:
Trong ựó:
C: Là số khuẩn lạc ựếm ựược trên ựĩa ựã chọn.
W1, W2: Số ựĩa ở 2 ựộ pha loãng liên tiếp ựã chọn thứ nhất và thứ hai. d1: Là hệ số của ựậm ựộ pha loãng ựã chọn thứ nhất.
N: Là số khuẩn lạc trong 1 gram mẫu kiểm tra, N biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 - 9,0 với 10w (w là số mũ của 10).
* Phương pháp xác ựịnh vi khuẩn E.coli có trong 1gram thịt
Xác ựịnh vi khuẩn E.coli theo quy trình xét nghiệm (TCVN 5155- 1990); lấy mẫu và chuẩn bị mẫu theo (TCVN 4833 Ờ 1;2:2002); ựịnh danh vi khuẩn bằng hệ thống máy Vitek.
- Nguyên lý: Dựa vào ựặc ựiểm Coliform phát triển lên men ựường lactose, sinh hơi. Vi khuẩn E.coli phát triển tốt ở ựiều kiện 420C trên môi trường CLP (Canh thang Lactose ựỏ Phenol) và khuẩn lạc E.coli xuất hiện màu ánh kim trên môi trường Endo. Số liệu thu thập ựược tra bảng MPN xác ựịnh số Coliforms và chỉ số E.coli.
Nuôi cấy: Mẫu ựồng nhất ựược pha loãng ở 10-1, 10-2,10-3,.. tùy theo dự ựoán mức ựộ ô nhiểm, hút 1ml mẫu pha loãng ở các ựộ ựậm ựộ chuyển nuooi cấy trong môi trường CLP. để xác ựịnh Coliform, mỗi ựậm ựộ pha loãng cấy
C
∑
(W1 +0.1W2).d1 N =
5 ống, mỗi ống chứa 5ml môi trường CLP, ựể tủ ấm 370C. để xác ựịnh
E.coli, mỗi ựậm ựộ cũng cấy 5 ống như xác ựịnh Coliform, chỉ khác là các ống CLP này ựặt ở tủ ấm 42oC/24-48h.
đọc kết quả:
- Xác ựịnh và tắnh số lượng Coliform: Các ống môi trường CLP nuôi cấy ở nhiệt ựộ 37oC/24h, môi trường từ màu hồng ựỏ chuyển sang mà vàng (phản ứng lên men ựường lactose dương tắnh, làm thay ựổi pH vì thế môi trường chuyển sang màu vàng), trong ống durham có sinh hơi. Ghi chép các ống dương tắnh, tra bảng MPN ựể tắnh Coliform tổng số.
- Xác ựịnh và tắnh chỉ số E.coli:
Sau nuôi cấy 24-48h, từ các ống CLP dương tắnh (môi trường chuyển màu từ hồng sang ựỏ sang vàng, có sinh khắ trong ống Duharm), cấy chuyển sang môi trường thạch Endo. Khuẩn lạc E.coli sinh ánh kim trên môi trường Endo sau khi nuôi cấy ở 420C/24h.
để xác ựịnh chắnh xác E.coli, từ khuẩn lạc có ánh kim, cấy chuyển khuẩn lạc sang môi trường thạch máu ựể tủ ấm 420C/24h. Lấy khuẩn lạc mọc trên môi trường làm test oxydaza và chạy máy Vitek ựịnh danh vi khuẩn. Ghi chép các ống nghiệm dương tắnh, tra bảng MPN ựược số gần ựúng trực khuẩn
E.coli/1g mẫu xét nghiệm.
Trường hợp không dùng máy ựịnh danh vi khuẩn Vitek, giám ựịnh
E.coli bằng hệ thống phản ứng IMVIC, nếu là E.coli:
+ Phản ứng ựỏ methy: dương tắnh (M+), môi trường có mầu ựỏ. + Phản ứng Indol: dương tắnh (I+), môi trường có mầu ựỏ.
+ Phản ứng Voges Ờ proskauer: âm tắnh (Vi-), không mầu hoặc mầu vàng. + Phản ứng Simon Ờ Citrat: âm tắnh (C-).
* Phương pháp xác ựịnh vi khuẩn Salmonella có trong 25 gram thịt
Xác ựịnh vi khuẩn Salmonella (TCVN Ờ 5153, 1990); FOA (1992). Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu (TCVN Ờ 4833 Ờ 1 Ờ 2, 2002).
- Nuôi cấy tăng sinh: Cân 25g thịt (loại bỏ mở, gân, bạc nhạc) nghiền nhuyễn trong cối sứ, sau ựó cho vào bình tam giác vô trùng có chứa 225 ml môi trường Selenit, ựể tủ ấm 370C, 24giờ.
- Phân lập trên môi trường chọn lọc: Dùng que cấy vô trùng, ria cấy canh trùng từ môi trường tăng sinh sang môi trường thạch Brilliant gram và Macconkey những khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella thường mọc thành những khuẩn lạc tròn, trong, không màu, nhẵn bóng và hơi lồi giữa. Trên môi trường thạch Brillitant green những khuẩn lạc như Salmonella có màu hồng, nhỏ, trong trên nền ựỏ sáng.
- Kiểm tra ựặc tắnh sinh hoá của vi khuẩn Salmonella
+ Nuôi cấy trên môi trường thạch sắt ba ựường (TSI): Lấy khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường chon lọc lấy chuyển sang môi trường TSI theo phương pháp cấy trắch sâu, ựể ủ ấm 370C, 24 giờ, ựọc kết quả. Nếu là vi khuẩn Salmonella mặt nghiêng ống môi trường TSI có mầu ựỏ (nghĩa là không phân giải Lactose và sucrose), thân và ựáy có mầu vàng, có bọt khắ và vết nứt (Phân giải Glucose, sinh hơi), có mầu ựen (Sinh H2S).
+ Nuôi cấy trên môi trường Lysine decarboxylase: Phản ứng dương tắnh có màu tắm, âm tắnh màu vàng.
+ Nuôi cấy trên môi trường urê: Salmonella có phản ứng âm tắnh, môi trường không chuyển màu.
+ Phản ứng Indol: Nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường Peptone, ủ 370C, 24 Ờ 48 giờ, sau ựó nhở vào 1ml thuốc thử, ựọc kết quả. Salmonella có phản ứng âm tắnh.
Peptone glucose, ủ 370C, 48 giờ. Salmonella có phản ứng âm tắnh không mầu hoặc vàng nhạt.
+ Phản ứng B Ờ Galactosidase (O.N.P.G): Nhỏ 1 giọt Toluen vào ống nghiệm chúa hỗn dịch 0,25ml nước muối ựẳng trương với khuẩn lạc, lắc ựều ủ cách thuỷ 370C, 15 phút, nhỏ tiếp 0,25ml thuốc thử lắc ựều, ủ cách thuỷ 370C, 24 giờ, Salmonella phản ứng âm tắnh không chuyển màu, dương tắnh màu vàng.
Chọn khuẩn lạc ựiển hình có thể giám ựịnh bằng phản ứng ngưng kết với kháng nguyên.
* Phương pháp xác ựịnh số lượng vi khuẩn Staphylococcus aureus có trong 1 gram thịt.
Xác ựịnh khuẩn Staphylococcus aureus theo quy tình TCVN 5156 Ờ 1990 ; lấy mẫu và chuẩn bị mẫu theo TCVN 4833-1-2:2002
- Chuẩn bị mẫu: Lấy 225 gram thịt (loại bỏ mỡ, lấy cả chất lỏng) ựồng nhất mẫu với tỷ lệ 1 phần mẫu và 9 phần môi trường BHI bằng máy stomacher, thời gian 1 phút. Huyễn dịch thu ựược có ựộ pha loãng là 10-1. Tiếp tục pha loãng mẫu với các ựậm ựộ khác.
- Tiến hành nuôi cấy: một mẫu xét nghiệm phải cấy ắt nhất 3 ựậm ựộ liên tiếp nhau, mỗi ựậm ựộ cấy vào 2 ựĩa thạch Bair-parker. Nuôi cấy ở nhiệt ựộ 370 C ổ 10 C trong 24 Ờ 48h.
đếm số khuẩn lạc: Căn cứ vào ựặc ựiểm Staphylococcus aureus phát triển tốt trong môi trong Barid Ờ Parker tạo khuẩn lạc mầu ựen, lồi, tròn, bờ ựều, bóng và có vòng trong suốt ở xung quanh do sự dung giải protein của lòng ựỏ trứng. Giám ựịnh Staphylococcus aureus bằng cách thực hiện các phép thử kiểm tra ựặc tắnh làm ựông huyết tương của vi khuẩn.
- Giám ựịnh Staphylococcus aureus bằng cách thực hiện các phép thử kiểm tra ựặc tắnh làm ựông huyết tương của vi khuẩn.
Thử phản ứng ựông vón trên phiến kắnh: Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý lên phiến kắnh, dùng que cấy lấy vi khuẩn vừa ựủ trộn thành nhuyễn dịch ựục ựều, nhỏ tiếp một giọt huyết tương vào (thắ nghiệm ựối chứng một giọt nước muối sinh lý, một giọt huyết tương), sau ựó quan sát khả năng ựông huyết tương trên phiến kắnh bằng kắnh lúp hoặc kắnh hiển vi.
Trường hợp thử ựông vón trên phiến kắnh là âm tắnh, có thể làm tiếp phản ứng ựông vón trong ống nghiệm. Chọn mỗi loại 5 khuẩn lạc nghi ngờ
Staphylococcus aureus nuôi cấy trong môi trường BHI, ựể tủ ấm 350C - 370 C/24h. Sau ựó lấy canh trùng cho vào huyết tương theo tỷ lệ 1:3 (0,1ml canh trùng với 0,3ml huyết tương thỏ) ựể tủ ấm 370 C trong vòng 2, 4, 6, 8 - 24 giờ và ựọc kết quả. Nuôi cấy trên môi trường thạch Chapman, khuẩn lạc
Staphylococcus aureus tròn, hơi ựục, mặt nhẵn, viền mép gọn, màu vàng
Kết quả ựược tắnh theo công thức:
Số khuẩn lạc ựếm ựược x x
Bảng 3.1 đánh giá kết quả theo Sperber và Tatini
Huyết tương ựông cứng sau 4-
6h khó di ựộng 4(+) Xác ựịnh là Staphylococcus aureus Huyết tương ựông chắc sau 6h
dễ di ựộng 3(+)
Không ựược xem là Staphylococcus aureus
Huyết tương ựóng thành cục
nhỏ sau 24h 2(+)
Không ựược xem là Staphylococcus aureus
Huyết tương ựông thành cục nhỏ không liên kết thành khối 1(+)
Không ựược xem là Staphylococcus aureus
1
Khối lượng mẫu nuôi cấu Xg =
1 Bội số pha loãng mẫu thử