IV. Xột nghiệm tế bào mỏu
A. Phương phỏp xột nghiệm bằng mỏy huyết học
1. những nguyờn tỏc cơ bản
- Mở cửa ở phớa ủằng sau của thiết bị; lấy ống tuýp ủỏ ra khỏi mỏy bơm nhu ủộng; nhớ khụng ủược
ngắt bất kỳ ủường kết nối nước nào. Bằng ủầu ngún tay xoa ống tuýp ủể lấy nốt chỗ dỏn ra. Lắp ủặt lại ống tuýp trờn ống bơm.
- ðặt bỡnh thuốc thử ở cựng mức của thiết bị (khụng ủược ủể mỏy ở dưới bàn làm việc) - kết nối với thuốc thử (chất pha loóng, dung dịch ủiện giải, chất tẩy rửa) và bỡnh ủựng chất thải với thiết bị kết nối lắp ủặt ở phớa ủằng sau của thiết bị.
- Sử dụng thuốc thử cụ thể cho Hema –screen 18. Trước khi sử dụng hóy kiểm tra hạn sử dụng và ủiều kiện lưu trữ.
- Sau khi ủó kiểm tra hệ thống ủiện ủó ủược lắp ủặt ở dưới ủất ủỳng chỗ thỡ nối thiết bị với ổ cắm ủiện. ủồng thời cũng phải kiểm tra xem sự kết nối dưới ủất khụng ủược làm ngắt ống kết nối. ngược lại, hóy nối dõy cỏp trực tiếp với nỳt bấm ủặt ở ủằng sau thiết bị.
- Nếu ủường dõy ủiện bị dao ủộng hoặc bị nhiễu loạn thỡ hóy sử dụng ổn ỏp (ups). Và nếu trong trường hợp này, hóy kiểm tra ủường dõy kết nối dưới mặt ủất và nếu khụng cú ổn ỏp thỡ hóy nối trực tiếp với nỳt bấm ở ủằng sau của thiết bị.
- Kết nối bàn phớm, con chuột, mỏy in với thiết bị. Cảnh bỏo: trong suốt quỏ trỡnh này, phải tắt mỏy in ủi.
- Hóy bật màn hỡnh lờn và theo chỉ dẫn hiện trờn video. Chỉ khi Main menu xuất hiện trờn video thỡ cú thể bật mỏy in lờn.
- Trước khi ủọc, thiết bị sẽ tự ủộng kiểm tra.
* Lưu ý: thụng thường thỡ thiết bị vừa mới ủược lắp ủặt, hoặc khụng ủược sử dụng trong vài ngày, thỡ trờn màn hỡnh sẽ xuất hiện cảnh bỏo hoặc lời nhắn trong quỏ trỡnh nú tự kiểm tra. Trong trường hợp này, hóy tự kiểm tra lại vài lần cho ủến khi thiết bị hoạt ủộng ủược bỡnh thường.
Mỏy phõn tớch mỏu Hema – screen 18 là một mỏy ủếm tế bào hoàn toàn tự ủộng ủược sử dụng trong chẩn ủoỏn.
Thiết bị kỹ thuật ủược phỏt triển với cụng nghệ hiện ủại ngày nay phục vụ cho từ phũng thớ nghiệm nhỏ ủến phũng thớ nghiệm vừa.
Mỏy phõn tớch cú thể xử lý tới 55 mẫu/ giờ với ủộ chớnh xỏc cao, lặp lại và cú khả năng tớch trữ hơn 1 triệu mẫu bao gồm cả biểu ủồ.
Mỏy quyết ủịnh 18 thụng số mỏu sau ủõy từ 1 mẫu mỏu 20 ỡl;
Giao diện cho phộp chuyển kết quả tới mỏy in bờn ngoài, tới mỏy tớnh cỏ nhõn và tới ổ ủĩa A.
Thiết bị cú thể ủược nõng cấp bất cứ thời gian nào và cú thể chuyển dữ liệu sang ổ A.
2. Miờu tả thiết bị 2.1. Núi chung
Mỏy phõn tớch mỏu Hema – screen 18 gồm những phần chớnh sau ủõy:
- Hệ thống lỏng: thực hiện cỏc chức năng: hỳt, mẫu, pha loóng, hỗn hợp, dung giải và rửa và mỏy tạo ra chõn khụng ủo ủược ủiều khiển.
- Hệ thống xử lý dữ liệu: ủếm và ủo thụng số mỏu, tạo ra và lưu trữ kết quả và biểu ủồ. - ụ ủiều khiển: bao gồm màn hỡnh, bàn phớm, thiết bị song song (mỏy in bờn ngoài),
mỏy tớnh, cổng dao diện. 1. Màn hỡnh 2. Vị trớ ủể mẫu 3. Kim hỳt mỏu 4. Bàn phớm 5. Con chuột Màn hỡnh: màu, vga 800 x 600, TFT, màn hỡnh. Vị trớ ủể mẫu: ủẩy vị trớ ủể mẫu, tự nú sẽ ủo mẫu. Bàn phớm: bàn phớm ủể bờn ngoài.
Con chuột bờn ngoài.
2.2. Bảng kết nối cỏc bộ phận ở ủằng sau
1. Bơm nhu ủộng 2. Kết nối chất tẩy rửa 3. Chất bóo hoà (dung hoà) 4. Kết nối bỡnh ủựng chất thải 5. Kết nối thuốc nổ ủồng loại 6. Quạt 7. ðĩa mềm 8. Kết nối mỏy in 9. Bàn phớm 10.Con chuột 11. Nỳt tắt / mở 12.Nguồn cung cấp 2.3. Chức năng của chất lỏng
Mẫu trước khi ủếm:
20ỡl mẫu mỏu ủược kim mẫu hỳt, và khoảng 4,5 ml chất pha loóng cho ủược thờm vào buồng trộn. Từ ủõy, khoảng 25ỡl chất pha loóng ủầu tiờn ủược kim mẫu hỳt và ủược cho thờm 5ml chất pha loóng vào buồng rbc, (chất pha loóng rbc). Chất pha loóng lần ủầu cũn sút lại trong buồng chảy qua ống tuýp vào buồng wbc, trong buồng này cú khoảng 0,6 ml thuốc thử dung giải ủược cho thờm vào (chất pha loóng wbc).
Tỷ lệ pha loóng là: 1. Chất pha loóng 1 :220
2. Chất pha loóng rbc : 1 :50.000 3. Chất pha loóng wbc : 1 :250 Thời gian ủo
1. ðếm wbc :∼ 4 giõy 2. ðo hbg : ∼ 2 giõy 3. ðếm wbc :∼ 9 giõy
3. Miờu tả phần mềm 3.1. Núi chung
Phần mềm bờn trong ủiều khiển hoạt ủộng của thiết bị, màn hỡnh, lưu trữ và nhớ lại dữ liệu và cho phộp người sử dụng ủo chuẩn.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Giỏo trỡnh Giỏo trỡnh Chẩn ủoỏn bệnh thỳ ……….144 Thiết bị sử dụng hệ thống thực ủơn ủể thực hiện và thay ủổi thiết lập. Người ủiều khiển cú thể chọn phớm bằng cỏch ấn vào màn hỡnh hoặc dựng chuột.
4. Nguyờn tắc hoạt ủộng 4.1. Phương phỏp trở khỏng :
Phương phỏp cơ bản ủược sử dụng trong hệ thống ủọc là một ống mao quản hỳt với 1 rỗ kim ủo chuẩn, ủược nhỳng vào một dung dịch thuốc bổ ủồng loại trong ủú mỏu ủược pha loóng. Hai ủiện cực ủược ủặt ở bờn trong và bờn ngoài chỗ mở tại ủú nguồn ủiện ủược ổn ủịnh.
Khi tế bào mỏu ủược truyển qua rỗ kim, ủiện trở giữa hai cực ủược thay ủổi. Sự thay ủổi này ủược chuyển vào xung lực, biờn ủộ của nú tương ứng với lượng mỏu
4.2. ðọc hemoglobin
Dung dịch dung giải Hb ủược cho thờm vào chất pha loóng wbc làm giảm dẫn hồng cầu, Hemoglobin ủược giải phúng và kết hợp với Xyanua tạo thành hợp chất ổn ủịnh Xyanua metan hemoglobin và hợp chất này ủược ủọc ở ủộ trắc quang là 546nm.
Nồng ủộ Hb cũng cú thể ủược ủo bằng thuốc thử khụng cú màu lục nam.
Thụng số : Tế bào bạch cầu – wbc Tế bào / l, tế bào / ỡl Tế bào hồng cầu – rbc Tế bào / l, tế bào / ỡl Nồng ủộ Hemogrobin – Hb (g/dl, g/l, mmol/l) Lượng hạt nhỏ - mcv (fl) Hematocrit – hct (Phần trăm, nguyờn chất) Nồng ủộ Hemoglobin hạt nhỏ - mchc (g/dl, g/l, mmol/l) *Phõn bổ tế bào hồng cầu, ủộ rộng – rdw – cv
- Tiểu huyết cầu – plt (tế bào / l, tế bào / ỡl)
Phõn bổ tiểu huyết cầu, ủộ rộng – pdw – cv (nguyờn chất)
- Lượng tiểu huyết cầu nhỏ - mpv (fl) thrombocrit – pct (phần trăm nguyờn chất) sự khỏc nhau của tế bào bạch cầu
- Lym, ly%: tế bào bạch huyết
- mid, mid %: monocytes và một số bạch cầu hạt ưa eozin
- gra, gr%: cỏc bạch cầu hạt neutrophil, eosinophil, và basophil
Số của bạch cầu:
wbc = wbc cal x (cels/l, cels/ỡl) Số của Leukocyte
rbc= rbc cal x (cels/l, cels/ỡl) ðược ủo trắc quang ở 540nm
Hb = Hb cal x (Hb ủược ủo – Hb mẫu) Lượng trung bỡnh của từng hồng cầu ủược lấy ra từ biểu ủồ
ðược tớnh toỏn từ giỏ trị rbg và mcv htc% = rbc x mcv x 100
htc nguyờn chất = rbc x mcv
Thành phần Hemoglobin trung bỡnh gồm hồng cầu, ủược tớnh từ giỏ trị rbc và hbc mhc = hb / rbc
ðược tớnh từ giỏ trị hb và hct mchc = Hb / htc nguyờn chất
ðơn vị ủo ủược hiển thị theo như ủơn vị ủó ủược chọn cho kết quả Hb (g/dl, g hoặc mmol/l).
ðộ rộng phõn bổ của bạch cầu và của tiểu huyết cầu ủược lấy ra từ biểu ủồ tại ủộ cao 20%
+ Phương phỏp ủếm bằng buồng ủếm
Số lượng hồng cầu trong mỏu rất lớn, cần phải pha loóng mới ủếm ủược. ðể pha loóng hồng cầu, thường dựng một số dung dịch sau ủõy.
Một số dung dịch pha loóng:
1. Dung dịch Marcano
Natri chlorur 0,6 g Natrixitrat 1,0 g Formol trung tớnh 36% 1ml
Nước cất 97,4 ml
Trộn ủều, quấy cho tan rồi lọc.
2. Dung dịch Hayem
Natri chlorur 1,0g
Natri sulfat kết tinh Na2SO4.10 H2O) 5,0g (Hoặc Natri sulfat khan Na2SO4 2,5g)
Thuỷ ngõn chlorur ( HgCl2) 0,5g
Nước cất tới 200ml
Trộn ủều, quấy cho tan rồi lọc. Cho vài giọt eosin 2% ủể dung dịch cú màu hồng nhạt dễ phõn biệt. 3. Natri chlorur 7,0 g Kali chlorur 0,2 g Natri xitrat 5,0 g Magie sulfat 0,04 g Nước cất 100 ml. Chỳ ý
+ Hai dung dịch (1 và 2) thường dựng.
+ ống hỳt pha loóng hồng cầu thường dựng ống Thoma. Hỳt mỏu ủến vạch 0,5, hỳt dung dịch pha loóng ủến 101. Như vậy, mỏu ủược pha loóng 200 lần.
+ Buồng ủếm: thường dựng buồng ủếm Neubauer và Goriaep.
Buồng ủếm Neubauer
Cú 2 buồng 2 bờn kớch thước 3x3 mm2. Mối buồng cú 9 ụ lớn, hỡnh vuụng, kớch thước mỗi ụ 1x1 mm2. 4 ụ lớn ở 4 gúc cú vạch chia ra 16 ụ trung bỡnh dựng ủể ủếm bạch cầu. ễ lớn chớnh giữa chia 25 ụ trung bỡnh, mỗi ụ trung bỡnh lại chia thành 16 ụ nhỏ.
ðếm hồng cầu ở 5 ụ trung bỡnh: 4 ụ 4 gúc và 1 ụ ở giữa. Buồng ủếm cú bề dày 1/10 mm. Lỳc ủậy Lamen mỗi ụ lớn tạo thành một thể tớch 1/10 mm3.
1. Hỳt mỏu vào ống pha loóng ủến vạch 0,5. Khụng nờn hỳt nhiều mỏu. Dựng tay hoặc bụng lau sạch mỏu ở ngoài.
2. Lập tức hỳt tiếp dung dịch loóng vừa ủỳng ủến 101.
3. Lấy ống cao su ra, rồi dựng ngún tay bịt 2 ủầu ống lại, ủảo nhẹ cho mỏu ủược trộn ủều.
4. ðậy Lamen lờn buồng ủếm. Cho dung dịch cầu ủó pha loóng vào. Chỳ ý bỏ ủi vài giọt ủầu. ðợi 2 –3 phỳt cho hồng cầu lắng xuống rồi ủếm.
Cỏch ủếm
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Giỏo trỡnh Giỏo trỡnh Chẩn ủoỏn bệnh thỳ ……….146 Mỗi ụ cú 4 cạnh, chỳ ý những hồng cầu nằm trờn 4 cạnh thỡ chỉ ủếm hồng cầu ở 2 cạnh.
Tớnh:
Gọi số hồng cầu ủếm ủược ở 5 ụ trung bỡnh là M, thỡ số hồng cầu trong 1 mm 3 là :
5
M
x 25 x 10 x 200 = M x 10.000
Số lượng hồng cầu bỡnh thường
Loại gia sỳc Bỡnh quõn triệu
trong 1 mm3 Tối thiểu Tối ủa
Ngựa Bũ Trõu La, lừa Cừu Dờ Lợn Chú Thỏ Gà Vịt 8,5 6,0 6,0 13,6 9,4 13,1 5,7 6,5 6,0 3,5 3,0 5,5 4,5 3,2 10,6 7,6 8,0 3,4 5,6 3,9 2,5 2,0 11,5 7,5 8,7 16,6 11,2 18,2 7,9 7,4 8,1 5,0 3,7
Khi cú bệnh số lượng hồng cầu cú thể thay ủổi
Số lượng hồng cầu giảm: + Thiếu mỏu do mất mỏu; + Thiếu mỏu do suy dinh dưỡng
+ Thiếu mỏu do suy tuỷ, do những bệnh món tớnh, ký sinh trựng ủường mỏu.
Số lượng hồng cầu tăng: trong thỳ y ớt gặp. Thường do cỏc nguyờn nhõn làm cơ thể mất nước như những bệnh gõy ỉa chảy, nụn mửa, ra nhiều mồ hụi; trong cỏc bệnh cú sốt cao,….
* Tỷ khối huyết cầu
Là tỷ lệ phần trăm của khối hồng cầu chiếm trong một thể tớch mỏu nhất ủịnh.
Mỏu ủể ủo tỷ khối huyết cầu cần chống ủụng và thường dựng mỏu tĩnh mạch
Phương phỏp ủo: theo phương phỏp Wintrobe Dụng cụ
- Mỏy ly tõm TH12
- ống ly tõm riờng (gọi là ống hematocrit). - Bản dẻo
Tiến hành
- Lấy mỏu cần xột nghiệm ủến 2/3 ống hematocrit, sau ủú chấm vào bản dẻo ủể vớt 1 ủầu ống hematocrit.
Mỏy ly tõm TH12
Thước ủo và ống hematocrit
- ðưa ống ly tõm cú mỏu vào mỏy ly tõm TH12. Sau ủú ly tõm với tốc ủộ 3000 vũng/phỳt với khoảng thời gian 5phỳt.
- Sau khi ly tõm, ủưa ống ly tõm vào thang ủo ủể ủọc chiều cao của cột hồng cầu, cú thể tớnh ngay tỷ lệ phần trăm giữa khối hồng cầu và mỏu toàn phần gọi là hematocrit.
Bỡnh thường, trờn khối hồng cầu cú một lớp mỏng bạch cầu và tiểu cầu khụng quỏ 1%. Nờn khi ủọc kết quả hematocrit căn cứ chiều cao cột huyết cầu coi là cột hồng cầu. Trong khi một số bệnh mà số lượng bạch cầu tăng quỏ nhiều, như bệnh Leucamia thỡ cần ủọc rừ cột hồng cầu, tiểu cầu, cột bạch cầu và phần huyết tương.
+ Hematocrit tăng: khi cú ứ nước trong tế bào, trong cỏc bệnh tăng số lượng hồng cầu;
+ Hematocrit giảm: trong cỏc trường hợp thiếu mỏu, suy dinh dưỡng, cỏc bệnh mạn tớnh.
Chỳ ý: Khi ủọc kết quả cần ủể ủầu dưới của cột hồng cầu trựng với vạch dưới của thước ủo, và ủầu trờn của cột huyết tương trựng với vạch trờn của thước ủo.
* Kớch thước của hồng huyết cầu
Thể tớch bỡnh quõn của hồng huyết cầu
Tớnh theo cụng thức:
Tỷ khối huyết cầu (hematocrit) x10 Thể tớch bỡnh quõn của hồng cầu, à m3 =
Số triệu hồng cầu / mm3
Vớ dụ: Số hồng cầu là 3.600.000 trong 1mm3, tỷ khối huyết cầu 39,2%. 39,2 x 10 392
Thể tớch bỡnh quõn của hồng cầu = = = 109 àm3 3,6 3,6
ý nghĩa chẩn ủoỏn
- Thể tớch hồng cầu tăng: trong trạng thỏi thiếu mỏu ưu sắc cú ủại hồng cầu hay hồng cầu khổng lồ
- Thể tớch hồng cầu giảm: trong trạng thỏi thiếu mỏu nhược sắc cú hồng cầu nhỏ. ðường kớnh bỡnh quõn của hồng cầu
ðo ủường kớnh của 200 – 500 cỏi hồng cầu dưới kớnh hiển vi, rồi lấy số bỡnh quõn. Vớ dụ: số hồng cầu cú ủường kớnh 6,5 à m3 10% thỡ
6,5 x 10 = 65 7 à m 60 % thỡ 7x60 = 420 7,5 à m 20% thỡ 7,5 x 20 = 150 8 à m 10% thỡ 8 x 10 = 80
Vậy ủường kớnh bỡnh quõn của hồng cầu là: 715 = 7,15 100 Thể tớch bỡnh quõn ðộ dày bỡnh quõn của hồng cầu = ðường kớnh bỡnh quõn 2 ẽ 2 Vớ dụ: Thể tớch bỡnh quõn là 87 à m3. ðường kớnh bỡnh quõn: 7 à m.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Giỏo trỡnh Giỏo trỡnh Chẩn ủoỏn bệnh thỳ ……….148 Vậy ủộ dày bỡnh quõn của hồng cầu:
87 87 = = 2,26 7 2 3,1416 x 38,5 2 * Hỡnh thỏi hồng cầu
Phiết kớnh và nhuộm tiờu bản mỏu
Mục ủớch của phiết kớnh là dàn mỏng cỏc huyết cầu trờn phiến kớnh và sau khi nhuộm cú thể phõn biệt cỏc loại huyết cầu dễ dàng. Muốn vậy, phiến kớnh phải tuyệt ủối sạch sẽ, khụng cú vết mờ, khụng toan khụng kiềm. Phiến kớnh mới mua về phải rửa sạch bằng nước ló, rồi ủun trong nước xà phũng, sau cựng lại ủun bằng nước ló, rửa thật sạch, chựi khụ bằng vải sụ và ngõm vào trong hỗn hợp cồn ete ( lượng bằng nhau) ủể bảo quản. Khi dựng thỡ lấy ra lau khụ.
Những phiến kớnh ủó dựng rồi phải rửa sạch vết dầu bằng xylon, sau ủú lại xử lý như trờn.
Thường dựng mỏu ở tĩnh mạch tai. Bỏ vài giọt dầu rồi cho một giọt lờn rỡa phiến kớnh. Dựng một phiến kớnh khỏc cú cạnh bằng phẳng (cú thể mài cho phẳng), tốt nhất là dựng lamen, ủể vào giữa phiến kớnh rồi lại cho tiếp xỳc với giọt mỏu. Cho giọt mỏu chảy ủều sang hai bờn. Nếu giọt mỏu to thỡ nhấc lamen sang một vị trớ khỏc, rồi với một gúc 45 ủộ, ủẩy nhẹ lamen về phớa ủằng kia của phiến kớnh ủể dàn ủều mỏu.
Một phiến kớnh tốt là khụng quỏ dày hoặc mỏng, phiết ủều ủặn. Chỳ ý, một giọt mỏu chỉ nờn phiết một phiến kớnh. Muốn phiết phiến kớnh khỏc thỡ lấy giọt mỏu mới.
ðể phiến kớnh vừa phiết xong trong rõm mỏt và dựng cỏc dung dịch sau ủõy ủể cố ủịnh hỡnh thỏi huyết cầu.
- Cồn metylic ( methanol), cố ủịnh 5 phỳt - Cồn ethylic tuyệt ủối, cố ủịnh 10 – 20 phỳt
- Axetụn 5 phỳt
- Cồn ethylic và ether ethylic
( lượng bằng nhau) 15 – 20 phỳt
- Hỗn hợp axeton và cồn methylic
( lượng bằng nhau) 5 phỳt
Sau lỳc cố ủịnh ủể phiến kớnh khụ trong khụng khớ rồi nhuộm.
Thường dựng thuốc nhuộm Giemsa, Wright ủể nhuộm. Chất nhuộm màu chủ yếu trong hai thuốc nhuộm này là eosin và methylen xanh dưới dạng muối trung tớnh.
Tỏc dụng của eosin: Eosin trong thuốc nhuộm thường ở dạng Natri eosinat, chớnh là sản phẩm của eosin toan tớnh cho thờm NaOH. Trong Natri eosinat, eosin mang ủiện õm, là bộ phận nhuộm màu, cho nờn nú là thuốc nhuộm toan tớnh, dễ dàng kết hợp với những vật thể