III. Hoỏ tớnh của mỏu
5.Protein huyết thanh
Việc xỏc ủịnh Protein tổng số và cỏc tiểu phần của nú trong huyết thanh cú nhiều ý nghĩa trong chẩn ủoỏn bệnh, ủặc bịờt là chẩn ủoỏn rối loạn chức năng gan.
E ống thử mg % bilirubin =
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Giỏo trỡnh Giỏo trỡnh Chẩn ủoỏn bệnh thỳ ẦẦẦ.126 Trong thỳ y, thường phải ủịnh lượng protein trong huyết thanh và tớnh cỏc tiểu phần của nú bằng phương phỏp ủiện di huyết thanh trờn giấy hoặc ủiện di trờn phiến Axetatcellulo.
a. định lượng protein tổng số trong huyết thanh
Cú nhiều phương phỏp ủịnh lượng:
- định lượng protein huyết thanh bằng phương phỏp cõn theo Fleury
Nguyờn tắc: Làm ủụng vún protein bằng alcol cao ủộ ở pH thớch hợp và nhiệt ủộ sụi. Rửa tủa bằng nước sụi, trỏng bằng alcol, ete, sấy khụ ở 1000C rồi cõn.
- định lượng protein huyết thanh bằng phản ứng Biure
Nguyờn tắc: Cho tỏc dụng với sunfat ủồng và NaoH, protein (cú liờn kết peptit) tạo thành phức chất cú màu hồng tớm. So với biểu ủồ màu ủể tớnh lượng protein.
- định lượng protein bằng phương phỏp Lõu Ri
Nguyờn tắc: Cơ sở của việc ủịnh lượng là khả năng của những dẫn xuất ủồng của protein cú thể khử thuốc thử Folin tạo thành những sản phẩm cú màu. So với biểu ủồ mẫu ủể tớnh lượng protein trong dung dịch.
- định lượng protein huyết thanh bằng khỳc xạ kế.
Nguyờn tắc: tia sỏng qua mụi trường dịch thể cú ủộ ủậm nào ủú ủều bị bẻ góy một gúc ủộ nhất ủịnh. Mụi trường càng ủậm, gúc ủộ bẻ góy càng lớn. Dựa vào ủộ bẻ góy ủú (ủộ khỳc xạ) ủể tớnh ủộ ủậm cuả mụi trường
độ khỳc xạ của cỏc dịch thể trong cơ thể (huyết thanh, dịch thẩm xuất, dịch thẩm lậu ở trong cỏc xoang tổ chức) về cơ bản phụ thuộc hàm lương protein trong ủú, và vỡ vậy cú thể căn cứ hệ thống khỳc xạ của huyết thanh ủể tớnh hàm lượng protein huyết thanh.
Người ta dựng khỏ rộng rói khỳc xạ kế trong việc ủịnh lượng protein và cỏc thành phần của nú trong huyết thanh.
* định lượng protein huyết thanh bằng khỳc xạ kế.
điều chỉnh khỳc xạ kế: Trước khi ủịnh lượng protein huyết thanh phải cho vài giọt nước cất lờn mỏy, vạch ủo, ủường ranh giới hai miền tối sỏng phải trựng với số 0 ở phớa % ( %, ủo ủường) và 1.3330 phớa ghi chỉ số khỳc xạ và nếu vạch ủo và ủường ranh giới hai miền tối sỏng khụng ủỳng với yờu cầu trờn, thỡ phải ủiều chỉnh lại mỏy cho ủỳng.
Cỏch ủịnh lượng
Huyết thanh phải tươi và trong suốt. Cho 2 giọt huyết thanh lờn mỏy, ủậy nắp lăng kớnh và ủiều khiển nắp sao cho vạch ủo và ủường ranh giới 2 miền tối sỏng trựng nhau. đọc số trờn mỏy và tra bảng ủể tớnh kết quả.
Vớ dụ: Hệ số khỳc xạ trờn mỏy là 1,34910 thỡ hàm lượng protein tương ứng trờn bảng là 7,63% ( cũng chớnh là 7,63 g%).
* định lượng albumin và globulin trong huyết thanh
Hoỏ chất
Dung dịch amụn sunfat bóo hoà: 7,54 g ( NH4)2SO4 hoà tan trong 100 ml nước cất. Axit axetic 0,04 N: 2,28 ml axit axetic bốc khúi hoà với nước cất ủến 1 lớt.
Tiến hành
Lấy 4 ống nghiệm ủỏnh số thứ tự 1,2,3 và 4 rồi cho vào giỏ ống nghiệm. Cho vào ống 3 và 4 mỗi ống 1 ml nước cất; ống 2 và ống 4, mỗi ống 1 ml ( NH4)2SO4 bóo hoà ủể lắng globulin. Cho vào ống 1 và ống 3, mỗi ống 1 ml axit axetic 0,04 N; ống 1 và ống 2 mỗi ống
1ml huyết thanh. đậy kớn cỏc ống nghiệm bằng nỳt cao su, rồi lắc ủều ( ớt nhất 20 lần). Lấy ống 1 ủem ủun cỏch thuỷ 3 phỳt. để nguội, tỏch mảng protein ủụng vún ra và lấy phần nước trong cho ra một ống ly tõm, ly tõm 5 phỳt ủể cho thật trong suốt. Ly tõm ống thứ 2 trong 30 phỳt. Lần lượt ủo trờn mỏy khỳc xạ kế dung dịch trong suốt của ống thứ 1, ống 2 và cỏc ống 3 và 4 ủược hệ số khỳc xạ. ống thứ nhất ủo ủược hệ số khỳc xạ của dung dịch khụng cú protein, vỡ protein ủó bị lắng; ống thứ 2 Ờ hệ số khỳc xạ của albumin, vỡ globulin ủó lắng. đo tất cả cỏc ống trờn cũng ủược tiến hành tương tự như ủo huyết thanh trờn mỏy khỳc xạ kế và ghi lại số trờn khỳc xạ kế của từng ống.
Cỏch tớnh:
Số ủo ủược ở ống 1,3,4 là chỉ số khỳc xạ của những dung dịch khụng cú protein. Lấy hệ số khỳc xạ của ống 2 trừ ủi (-) hệ số khỳc xạ ống 4, rồi nhõn 2 ( x) sẽ ủược kết quả hệ số khỳc xạ của albumin và những chất ngoài protein (I).
Lấy hệ số khỳc xạ của ống 1 trừ ủi hệ số của ống 3, rồi nhõn 2 sẽ ủược hệ số khỳc xạ những chất ngoài protein (II) sẽ ủược hệ số khỳc xạ cuả albumin.
để tớnh lượng phần trăm albumin trong huyết thanh thỡ lấy hệ số khỳc xạ của albumin trờn chia cho 0,00177 ( 0,00177 là hệ số khỳc xạ của dung dịch albumin 1%).
Tớnh hàm lượng globulin bằng cỏch lấy hệ số khỳc xạ của huyết thanh trừ ủi tổng số của hệ số khỳc xạ của nước cất, hệ số khỳc xạ của ống khụng protein và ống albumin ( ống 1), kết quả thu ủược chia cho 0,00229 ( là hệ số khỳc xạ của dung dịch globulin 1%) sẽ ủược số gam phần trăm ( g%) glubulin trong huyết thanh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Vớ dụ:
1. hệ số khỳc xạ của nước 1,3330
2. hệ số khỳc xạ dung dịch khụng protein ( ống 1) 1,3345 3. hệ số khỳc xạ ống albumin ( ống 2) 1,3769 4. hệ số khỳc xạ của axit axetic 0,04 ( ống 3) 1,3333 5. hệ số khỳc xạ của ( NH4)2SO4 bóo hoà ( ống 4) 1,3718 6. hệ số khỳc xạ của huyết thanh 1,34873 Thỡ: 1. 1,3769 Ờ 1,3718 = 0,0057 x 2 = 0,0102 2. 1,3345 Ờ 1,3333 = 0,0012 x 2 = 0,0024 3. 0,0102 Ờ 0,0024 = 0,0078 4. 0,0078 : 0,00177 = 4,50% 5. 0,0102 + 1,3330 = 1,3432 6. 1,34873 Ờ 1,3432 = 0,00553 7. 0,0053 : 0,00229 = 2,41% ( globulin) 8. 4,50 : 0,00229 = 1,8 ( A/G) ý nghĩa chẩn ủoỏn
- Protein huyết thanh thấp trong cỏc trường hợp sau:
+ Do hấp thụ protein vào cơ thể thiếu: dinh dưỡng kộm, ủúi lõu ngày, bệnh mạn tớnh ở ủường tiờu hoỏ; cơ thể cần nhiều protein mà cung cấp khụng ủủ như cú thai, tiết sữaẦ.
+ Chức năng tạo protein rối loạn: bệnh ở gan làm giảm quỏ trỡnh tạo albumin. Cỏc trường hợp thiếu mỏu, trỳng ủộc, cỏc bệnh cấp tớnh và món tớnh, cỏc quỏ trỡnh viờm.
+ Cơ thể mất protein: ủỏi ủường, cường năng giỏp trạng, sốt cao mạn tớnh, ngoại thương, bệnh ở thận,Ầ.
+ Cỏc trường hợp chảy mỏu nặng, bỏng diện rộng, tớch nước xoang ngực, xoang bụng.
- Protein huyết thanh tăng
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Giỏo trỡnh Giỏo trỡnh Chẩn ủoỏn bệnh thỳ ẦẦẦ.128
b. điện di protein huyết thanh
Protein huyết thanh bao gồm Albumin và Globulin. Dựng phương phỏp ủiện di người ta chia cỏc Protein huyết thanh thành 4 phõn suất lớn: Albumin, α, β và γ - globulin.
Do ủiện tớch, tớnh chất lý hoỏ khỏc nhau, Nếu ủặt protein trong một từ trường dũng ủiện một chiều, chỳng sẽ di chuyển, cỏc thành phần nhỏ ủược tỏch ra và cú thể ủịnh lượng ủược từng tiểu phần một.
Cú nhiều phương phỏp ủiện di ủưa vào cỏc chất làm giỏ khỏc nhau: ủiện di trờn giấy, ủiện di trờn thạch, ủiện di trờn màng cellulose axet. Trong lõm sàng hiện nay thường dựng ủiện di trờn màng cellulose axet.
* Kỹ thuật ủiện di huyết thanh trờn giấy:
+ Giấy ủiện di. + Dung dịch ủệm gồm:
1. dung dịch Veronal pH: 8,6
Natri Veronal 15,45 g Axit verronal 2,76 g Nước cất ủến 1000 ml
Nếu khụng ủạt pH = 8,6 thỡ phải ủiều chỉnh.
2. Dung dịch borat Natri borat : 8,8g Axit boric: 4,65g Nước cất ủến 1000ml; pH = 8,6. 3. Dung dịch nhuộm: + Bromofenol bleu 1% Bromofenol bleu 1,0g
Dichlo thủy ngõn ( HgCl2) bóo hũa trong cồn 95 o C 100ml + Bromofenol bleu 0,05 g
HgCl2 1,00g
Axit axetic glacial 20,00ml Nước cất vừa ủủ 100,00ml
Cho ớt nước hũa tan HgCl2, rồi cho Bromofenol bleu hũa tan, sau ủú cho axit axetic và sau cựng cho nước ủến 100ml.
4. Dung dịch rửa:
0,5% axit axetic
5. Dung dịch chiết màu: NaOH 0,01N Thao tỏc:
Cắt giấy ủiện di rộng 2 Ờ 3 cm, dài ủến ủầu chậu ủựng dung dịch ủệm; dựng bỳt chỡ gạch một ủường khoảng giữa cực õm và cực dương, hơi dịch một ớt về phớa cực õm.
Nhỳng giấy ủiện di và dung dịch ủệm rồi ủặt lờn giấy lọc ủể thấm khụ.
Dựng ống hỳt bạch cầu hỳt 0,01 Ờ 0,02 ml huyết thanh, vạch nhẹ lờn giấy theo ủường bỳt chỡ ủó vạch sẵn sao cho huyết thanh làm thành một ủường gọn. Cho nhẹ nhàng 2 ủầu giấy vào chậu dung dịch ủệm, ủậy nắp lại, ủể 30 phỳt. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đúng mạch ủiện và ủiều hcỉnh ủiện thế khoảng 8 Ờ 10 Volt cho 1 cm chiều dài và 0,1 mA cho 1 cm chiều rộng băng giấy. Cho mỏy chạy liờn tục trong 4 Ờ 5 giờ. Tắt mỏy, lấy những băng giấy ủem hong khụ trong tủ sấy 100 o C trong 10 phỳt; cú thể ủể khụ trong khụng khớ.
Nhuộm trong dung dịch bromofenol bleu 1% trong 5 phỳt hoặc trong cỏc dung dịch. Cắt băng giấy theo từng thành phần prrotein rồi cho từng phần vào dung dịch chiết màu NaOH 0,01N, mỗi ống 5 ml cho mỗi thành phần. Ngõm trong 30 phỳt cho màu thụi hết.
Sau ủú, so màu với kớnh lọc màu lục hoặc λ = 525 Ờ 595 àm. ống trắng bằng NaOH 0,01 N.
Từ kết quả so màu tớnh tỷ lệ phần trăm cỏc tiểu phần.
Cỏc tiểu phần protein huyết thanh
+ Anbumin (Albumin): ủược tổng hợp ở nhu mụ gan từ ỏc axit amin.
Anbumin cú vai trũ rất quan trọng trong việc giữ ỏp lực thẩm thấu của mỏu, như Ộchất chuyển vậnỢ cỏc axit bộo (lipoprotein), sắt (transfer), iot (iodoproteic), cỏc hormon (hormon oestrogen trong cỏc lipoprotein). Cỏc carotenoit (trong lipoprotein), cỏc bilirubin (dạng bilirubinalbumin), calci, axit mật, axit uric, axit bộo, cỏc vitamin C, K, P,Ầvà nhiều chất khỏc, là cỏc chất lạ ủối với cơ thể như cỏc thứ thuốc,Ầ
Trong cỏc trường hợp bệnh, khụng gặp Anbumin tăng, thường giữ nguyờn hoặc giảm.
Anbumin giảm thường thấy trong: Suy dinh dưỡng, gan tổn thương; Anbumin niệu. α
α α
α- globulin: di chuyển chậm sau Anbumin, gồm nhiều loại prrotein cú cựng một ủiện
tớch và kớch thước nhỏ. Thường cú 2 tiểu phần α1 và α2- globulin.
+ α1- globulin phần lớn do gan tạo ra. Nú cú nhiệm vụ quan trọng vận chuyển cỏc vitamin hũa tan trong lipit, ủồng (Cu), cỏc hormon,Ầ Hypertensinogen cũng trong thành phần của α1- globulin.
* Tăng α- globulin (thường tăng α2) gắn liền với glucoprotein tăng, thường ủi kốm theo thay ủổi bạch cầu. Cỏc trường hợp viờm gan do nhiễm trựng α- globulin khụng tăng.
* α- globulin giảm trong thiếu mỏu do dung huyết. β
β β
β- globulin: khụng ủồng nhất, di chuyển chậm hơn α- globulin. Cỏc β- globulin chứa
nhiều lipit và cỏc phức hợp lipoprotein ủược tạo ra ở gan. β- globulin tăng trong cỏc bệnh ở gan, hư thận, viờm, phự, ủỏi ủường, cỏc bệnh nhiễm trựng.
γγγγ- globulin: bỡnh thường khụng chứa lipit, khụng quỏ 1% hợp chất gluxit gồm phần
lớn cỏc khỏng thể và cỏc protein khỏc cú tớnh chất khỏng thể. Nờn γ- globulin khụng thuần nhất.
γ- globulin tăng trong tổn thương gan món tớnh, cỏc bệnh tim mạch. Trong cỏc chứng viờm, γ- globulin tăng cựng sự thay ủổi bạch cầu.
γ- globulin giảm trong hư thận.
Nếu ủiện di huyết tương cũn cú tiểu phần fibrrinogen. Fibrrinogen ủược tạo ra chủ yếu ở gan; cũn cú thể do tủy xương và một số cơ quan khỏc. Fibrrinogen cú tỏc dụng làm ủụng mỏu.