III. Hoỏ tớnh của mỏu
4. Bilirubin (sắc tố mật) trong mỏu
Lượng bilirubin trong mỏu rất ớt, nhất là bilirubin kết hợp ( cholebilirubin )
Ba trường hợp sau ủõy bilirubin tớch lại nhiều trong mỏu gõy hội chứng hoàng ủản:
- Những bệnh làm tắc ống dẫn mật (sỏi mật, giun sỏn chui ống mật, viờm ống dẫn mật.), bilirubin kết hợp khụng ra ủược tỏ tràng, tớch lại trong mỏu.
- Nhu mụ gan tổn thương (do viờm, xơ,Ầ), bilirubin tự do tăng ( Hemobilirubin ) và bilirubin kết hợp tăng trong mỏu
- Những bệnh gõy toan huyết (do kớ sinh trựng ủường mỏu, do trỳng ủộc), hồng huyết cầu vỡ nhiều, bilirubin tự do tăng nhiều trong mỏu.
* Cỏc phản ứng tỡm bilirubin trong mỏu (huyết thanh huyết tương)
Tất cả cỏc phản ứng tỡm bilirubin trong huyết thanh ( huyết tương) ủều dựa trờn nguyờn tắc:
Bilirubin + dung dịch diazo = azobilirubin cú màu hồng. Nếu bilirubin tự do thỡ phải ủược hoà tan trong dung mụi hữu cơ ( thường dựng cồn 90 o, dung dịch cafein, ure benzoat Natri.)
a. Phương phỏp ủịnh tớnh:
* Phản ứng Vandenben (Van den Bergh)
Mục ủớch: - Nhằm xỏc ủịnh trong huyết thanh cú bilirubin kết hợp tăng hay bilirubin
tự do tăng.
- Trong chẩn ủoỏn cũn dựng phõn biệt cỏc trường hợp hoàng ủản.
Ngày nay, xột nghiệm bilirubin trong huyết thanh thường ủược ủịnh lượng, phản ứng Vandenbergh ớt ủược sử dụng.
Hoỏ chất:
1. Dung dịch Ehrlich:
Ehrlich I Axit sulfanilic: 1,0 g
HCl ( d = 1,19): 15,0 ml Nước cất vừa ủủ: 1000 ml
Ehrlich II Natri Nitris ( NaNO2): 0,5 g
Nước cất ủến: 100 ml
Dung dịch Ehrlich I dựng ủược lõu dài, dung dịch Ehrlich II chỉ cú tỏc dụng trong vũng 6 tuần.
Khi dựng, lấy 10 ml dung dịch Ehrlich I trộn với 0,3 ml dung dịch Ehrlich II sẽ ủược dung dịch diazon dựng trong phản ứng.
2. Cồn 95 o
Thao tỏc
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Giỏo trỡnh Giỏo trỡnh Chẩn ủoỏn bệnh thỳ ẦẦẦ.124 Cho 1ml huyết thanh tươi (huyết tương) vào một ống nghiệm nhỏ, rồi theo thành ống giỏ từ từ 0,5 ml dung dịch diazo lờn trờn huyết thanh.
- Nếu chỗ tiếp xỳc xuất hịờn ngay màu hồng tớm là phản ứng trực tiếp dương tớnh. - Nếu sau 15 phỳt phản ứng mới xuất hiện: phản ứng trực tiếp chậm Ờ cũn gọi là phản ứng lưỡng tớnh.
- Sau 15 phỳt khụng xuất hịờn màu hồng tớm: phản ứng trực tiếp õm tớnh (-). Cho thờm 5 ml cồn, ngoỏy ủều. Nếu màu hồng tớm xuất hiện: Phản ứng giỏn tiếp dương tớnh.
ý nghĩa chẩn ủoỏn
* Với gia sỳc khoẻ
+ Phản ứng trực tiếp õm tớnh (-).
+ Phản ứng giỏn tiếp tuỳ loại gia sỳc: với huyết thanh bũ khoẻ, phản ứng giỏn tiếp khụng rừ; với ngựa, phản ứng diễn ra rất rừ, vũng hồng tớm khỏ ủậm.
* Trường hợp bệnh lý
+ Phản ứng trực tiếp dương tớnh: Những bệnh gõy tắc ống mật.
+ Phản ứng trực tiếp õm tớnh, phản ứng giỏn tiếp rừ: Những bệnh làm hồng huyết cầu vỡ nhiều
+ Phản ứng trực tiếp chậm: Những bệnh gõy tổn thương nhu mụ gan.
b. Phương phỏp ủịnh lượng bilirubin trong huyết thanh (huyết tương)
Cú nhiều phương phỏp. Nhưng phương phỏp thường dựng trong thỳ y là Bụcantruc và Rappaport
* định lượng bilirubin theo Bụcantruc
Hoỏ chất
Ehrlich I Axit sulfanilic: 1,0g HCl ( d = 1,19): 10,0 ml Nước cất: 200 ml
Ehrlich II Nitris Natri (NaN02): 0,5 %
Nước cất ủến: 100 ml
Khi dựng lấy 10 ml dung dịch Ehrlich I trộn với 0,3 ml dung dịch Ehrlich II.
Thao tỏc
Lấy 6 ống nghiệm nhỏ ủều nhau, ủỏnh số từ 1 ủến 6. Từ ống số 2, cho vào mỗi ống 0,5 ml nước muối sinh lý. Sau ủú, cho vào ống 1 và 2, mối ống 0,5 ml huyết thanh (hoặc huyết tương). Trộn ủều huyết thanh với nước muối trong ống thứ 2. Hỳt 0,5 ml trong ống thứ 2 cho qua ống thứ 3. Trộn ủều ống thứ 3, hỳt 0,3 ml cho qua ống thứ 4. Cứ như vậy cho ủến ống cuối cựng hỳt bỏ ủi 0,5 ml.
Như vậy cỏc ống ủó ủược pha loóng theo thứ tự:
ống 1 2 3 4 5 6
độ pha loóng 1 2 4 8 16 32
Cho vào mỗi ống 0,5 ml dung dịch diazo, trộn ủều, Nếu cú ống xuất hiện màu hồng là phản ứng trực tiếp.
Sau 15 phỳt, cho vào mỗi ống nghiệm 0,5 ml cồn, ống xuất hiện màu hồng cú ủộ pha loóng lớn hơn. đú là do cú phản ứng giỏn tiếp,
Cỏch tớnh:
Lấy ủộ pha loóng của ống xuất hiện màu hồng ủầu tiờn nhõn với 0,0016 ( tức là số bilirubin trong 1 ml dung dịch ủủ ủể cú phản ứng với diazo) nhõn với 100 = số mg % bilirubin.
Vớ dụ: ống thứ 2 xuất hiện màu hồng ủầu tiờn thỡ: 0,0016 x 2 x 100 = 3,2 mg % bilirubin .
Chỳ ý:
+ đỏnh dấu ống xuất hiện màu hồng ủầu tiờn khi chưa cho cồn ủể tớnh lượng bilirubin trực tiếp (cholebilirubin) và ống xuất hiện màu hồng ủầu tiờn sau khi ủó cho thờm cồn ủể tớnh lượng bilirubin tổng số. Lượng bilirubin giỏn tiếp (Hemobilirubin) là hiệu số của lượng bilirubin tổng số và lượng bilirubin trực tiếp.
+ định lượng theo phương phỏp Bụcantruc, hàm lượng bilirubin trong huyết thanh cú thể tăng ủến 3,2 mg%; ở ngựa: 6,4 mg %.
ý nghĩa chẩn ủoỏn: Trong cỏc bệnh: thuỳ phế viờm, lượng bilirubin trong huyết thanh tăng lờn 4 mg%. Cỏc bệnh huyết bào tử trựng, trỳng ủộc SO2, viờm nóo tuỷ truyền nhiễm Ờ bilirubin tăng.
* định lượng bilirubin trong huyết thanh theo Rappaport
Bệnh phẩm: huyết thanh, huyết tương
Hoỏ chất:
1. dung dịch Natri benzoat Ờ urờ:
Natri benzoat: 10g Natri urờ: 10g Nước cất vừa ủủ: 100 ml Ngoỏy cho tan, lọc lấy nước trong.
2. Dung dịch diazo ( như trong phản ứng Vandenbe)
3. Dung dịch HCl 1,5%
4.Dung dịch bilirubin chuẩn: Lấy 4,32 g coban sunfat khan hoặc 7,8 g Coban sunfat kết
tinh ( CoSO4. 7 H2O), cho thờm một ớt nước cất trong bỡnh ủịnh mức 100ml. Thờm vào 1ml H2SO4 ủặc ( C.P) rồi cho nước cất ủến 100 ml. dung dịch cú màu tương ủương 0,01 mg bilirubin trong 1 ml.
Thao tỏc
+ định lượng bilirubin trực tiếp (cholebilirubin)
Lấy 2 ống nghiệm A, B Ờ ống A làm ống trắng, ống B làm ống thử.
ở ống A cho vào 0,5 ml huyết thanh, 0,25 ml HCl 1,5% rồi thờm nước cất vừa ủủ 5 ml.
ở ống B Ờ 0,5 ml huyết thanh ; 0,25 ml dung dịch diazo rồi thờm nước cất vừa ủư 5 ml.
+ định lượng bilirubin tổng số:
ống C ( ống trắng): 0,5 ml huyết thanh; 0,25 ml dung dịch diazo rồi cho thờm dung dịch Natri benzoat Ờ urờ vừa ủủ 5 ml.
So màu trờn quang kế, kớnh lọc màu lục ( bước súng landa = 500 Ờ 540 micro met)
Tớnh:
E: mật ủộ quang học