III. Hoỏ tớnh của mỏu
6. ðạm ngoài protit
ðạm ngoài protein thường chiếm lượng nhỏ khoảng 1 – 2 % lượng ủạm cú trong mỏu ủộng vật, cũn 98 – 99 % là ủạm trong những chất protit. ðạm ngoài protit gồm cỏc chất: urờ, axit uric, creatinin, creatin, amoniac và ủạm trong cỏc axitamin.
Urờ
Kết quả thoỏi biến cỏc axit amin trong cơ thể sinh ra amoniac ( NH3) và một con ủường quan trọng nhất ủể chống ủộc amoniac là tạo thành ure ở gan ( trờn 50 % N nước tiểu là của ure) và ure ủược thận thải ra ngoài. Rối loạn chuyển húa amoniac ure cú liờn quan ủến chế ủộ ăn uống, sự thoỏi húa cỏc axit amin, tỡnh trạng gan và thận
Tăng ure huyết: Bệnh ở thận, nhất là khi viờm thận mạn tớnh.
Creatinin và creatin
Creatin là chất do gan và tụy tạo ra từ 3 axit amin : arginin, glyxin. Methionin và chủ yếu ở cơ dưới dạng Creatin phosphat
OH
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Giỏo trỡnh Giỏo trỡnh Chẩn ủoỏn bệnh thỳ ……….130 NH2 C OH HN = C N CH2 CH3 Creatin
Creatinin là sản phẩm thủy phõn Creatin phosphat, cú ở mỏu và ủào thải ra ngoài theo nước tiểu.
Creatinin tăng: cỏc bệnh thận và bớ ủỏi. Cường năg giỏp trạng, viờm hoại tử cơ.
Amoniac
Amoniac do chuyển húa proteit ở gan và từ ruột do lờn men của vi khuẩn. Amoniac tăng trong mỏu: gan tổn thương khụng chuyển ủược thành ure
* ðịnh lượng ủạm ngoài protit
Nguyờn tắc: ðạm ở trong nước mỏu sẽ bị dung dịch tiờu húa toan mạch chuyển thành Amoniac sulfat, rồi tỏc dụng với Natri hydrừyt thành Amoni hydrroxit. Sau ủú cho tỏc dụng với dung dịch Nessler ủể hiện màu.
Cũng xử lý như vậy với một dung dịch biết nồng ủộ ủạm trước, rồi suy ra nồng ủộ ủạm trong mỏu.
Cỏc phản ứng túm tắt như sau:
Chất cú chứa ủạm + H2SO4 (NH4)2SO4 (NH4)2SO4 + 2 NaOH 2 NH4OH + NaSO4
Amoni Hydroxyt NH4OH tỏc dụng với dung dịch Nessler ( HgI2 . 2KI )sẽ thành dimercuric amoni iodide ( NH2.Hg2I3)
2 NH4OH NH3 + 2 H2O
2 ( HgI2 . 2KI) + 2 NH3 2 ( NH2.Hg2I3) + 4 KI 2 ( NH3.HgI2) NH2.Hg2I3 + NH4I
Thuốc thử
Dung dịch Nessler (theo Kock và Mc Meekin cải tiến)
Lấy 22,5 g I2 cho vào 20 ml nước ủó cú sẵn 30 KI, lắc cho tan hết rồi cho thờm 30 g thủy ngõn, lắc cho tan. Trong quỏ trỡnh lắc dung dịch sẽ núng, nờn ngõm vào nước cho nguội bớt. Cho ủến lỳc tầng nước trong phần trờn hết màu vàng iod. Gạn Lấy phần nước trong ở trờn rồi cho thờm vào 1 ml amidon 1%. Chỳ ý xem cú màu xuất hiện khụng. Nếu khụng cú màu xanh xuất hiện chứng tỏ trong dung dịch cũn hợp chất thủy ngõn 2 ( Hg ++). Thờm dung dịch iod ( nồng ủộ như trờn ) vào dung dịch nước trong cho ủến lỳc xuất hiện màu xanh nhạt thỡ thụi. ðưa dung dịch trờn pha với nước cất tới 200 ml, trộn ủều. Sau cựng, cho thờm vào 975 ml NaOH 10 % ( nồng ủộ hết sức chuẩn ). Trộn ủều. Bảo quản trong chai nỳt mài ủể dựng lõu dài.
Cỏch pha 2: Cho 15,0 g KI vào trong 20 ml nước cất; thờm 20 g iod thủy ngõn, ngoỏy cho tan, rồi pha loóng bằng nước cất ủến 100 ml, lọc, rồi pha loóng ủến 200 ml.
Thờm vào 200 ml nước cất và 993 ml NaOh 10% ( nồng ủộ hết sức chuẩn). ðể yờn cho lắng cặn, dựng phần nước trong ở trờn.
Dung dịch Nessler phải cú ủộ kiềm nhất ủịnh. Thường ủiều chỉnh như sau : 11 – 11,5 ml dung dịch Nessler cần 20 ml HCl 1N ủể trung hũa ( chỉ thị màu phenolphtalein). Nếu ủịnh lượng N ngoài protit thỡ 1 ml H2SO4 50% cần 9 – 9,3 ml dung dịch Nessler ủể trung hũa.
Dung dịch ủạm chuẩn( 1 ml cú 0,03 mgN).
Sấy amoni sulfat (A.R) ở 1100C trong 30 phỳt rồi ủể vào bỡnh hỳt ẩm. Cõn thật chớnh xỏc 0,1415 g amoni sulfat cho vào bỡnh 1 lớt, rồi thờm vào 1 ml HCl ủậm dặc ủể ức chế vi khuẩn phỏt triển, rồi cho thờm nước cất ủến 1000ml.
Dung dịch tiờu húa:
Axit phosphoric ( H3PO4) 300ml ðồng sulfat 5% ( CuSO4) 50ml
Trộn ủều và cho thờm H2SO4 ủặc 100 ml. ðể yờn 1 tuần, Lấy phần nước trong ở trờn, pha gấp ủụi bằng nước cất.
Axit sulfuric 50% V V
Lấy 10 phần Axit sulfuric 50% và 1 phần dung dịch trờn trộn ủều ủược dung dịch tiờu húa. 1 ml dung dịch này phải cần 9 – 9,3 ml dung dịch Nesler ủể trung hũa, Nếu khụng phải ủiều hcỉnh nồng ủộ toan của nú.
Cỏc bước thao tỏc
Trộn ủều và ủun ống thử. Cú thể cho vào vài hạt bi thủy tinh. ðun cho ủến lỳc trong ống ủầy khúi, ủỏy ống từ màu ủen sang trong suốt. ðể cho nguội.
Trộn ủều, so màu bằng kớnh lọc màu xanh hoặc λ = 440 àm Tớnh
E thử /E chuẩn x 0,03 x
1 , 0
100 = mg% Nitơ ngoài protit
Chỳ ý:
1. Sau khi cho Nessler vào, dung dịch ủục cú thể do: + ðộ kiềm toan của Nessler khụng chuẩn
+ ðun chưa ủủ, dưới ống chưa trong suốt. + ðể thời gian quỏ lõu mới so màu. + Nồng ủộ ủạm ngoài protit quỏ cao.
Nước cất dựng ủể pha thuốc thử phải hoàn toàn khụng cú Nitơ.
Cỏch chế nước cất khụng cú Nitơ: Bộ dồ chưng nước cất hoàn toàn bằng thủy tinh. Cho 2000 ml nước cất, 0,25 ml H2S04 4 N và 2ml thuốc tớm 1% ( KMnO4) ủem chưng, bỏ ủi một phần nước ủầu và phần cuối.
Sau khi cho Nessler, Nếu khụng hiện màu, cú thể do dung dịch tiờu húa quỏ nhiều hoặc chưa tiờu húa xong trong lỳc ủun.
* ðịnh lượng urờ trong mỏu
Urờ trong mỏu sau khi cho tỏc dụng với men ureza sẽ chuyển thành amoni cacbonat H2N – CO – NH2 + 2 H2O ( NH4) 2 CO3
( NH4) 2 CO3 + 2 NaOH Na2CO3 + 2 NH4OH
Rồi cho tỏc dụng với dung dịch Nessler sẽ hiện màu. Cũng xử lý như vậy với dung dịch chuẩn ủể tớnh lượng urờ cần ủịnh lượng.
Thuốc thử :
1. Dung dịch ủạm chuẩn (1ml cú 0,05 mg N; pha như phần ủịnh lượng ủạm ngoài protit)
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Giỏo trỡnh Giỏo trỡnh Chẩn ủoỏn bệnh thỳ ……….132
2. Dung dịch phosphat axit di natri ( Na2HPO4): cõn 0,89 g phosphat axit di Natri ( Na2HPO4.12 H2O) C.P )pha với nước cất thành 100 ml.
3. Nước rỳt glyxerin ureza: Lấy 5 g bột ủậu tương, thờm vào 100 ml glyxerin, lắc 15 phỳt, ủể trong tủ ấm 24 giờ. Lấy phần nước trong trờn ủể dựng và bảo quản trong tủ lạnh 2 -3 thỏng.
4. Natri tungstat 10%; 5. H2SO4 2/3 N; 6. Dung dịch Nessler
Thao tỏc:
Dựng ống nghiệm nhỏ (15 x 100mm) cho vào 0,5 ml mỏu tươI toàn phần, 0,5 ml nước cất, 0,25 ml phosphat axit di natri và 0,25 ml dung dịch ureaza. Sau khi trộn ủều ngõm trong cốc nước 37 oC trong 20 phỳt. Lấy ra, thờm vào 1,5 ml nước cất, 1ml Natri tungstat 10% và 1ml H2SO4 2/3 N. Trộn ủều rồi ủem li tõm hoặc lọc qua giấy, lấy phần nước trong ở trờn ủưa ủi xột nghiệm theo thứ tự cỏc bước sau:
Cỏc ống (ml) Cỏc bước ống trắng ống chuẩn ống thử Nước mỏu lọc Dung dịch chuẩn ( 0,03 mg N/ml) Nước cất Dung dịch Nessler 0 0 8,0 2,0 0 1,0 7,0 2,0 2,0 0 6,0 2,0 Trộn ủều và ủưa so màu ngay. Dựng kớnh lọc màu xanh hoặc λ = 440 àm Tớnh: Tớnh: mg% ủạm ure = chuan thu E E x 0,03 = chuan thu E E x 15 Chỳ ý
- pH mụi trường ureza tốt nhất là gần trung tớnh. Nếu khụng trung tớnh thỡ dựng dung dịch phosphat di Natri ủể ủiều chỉnh.
- Nếu dựng bột ureza tinh khiết cú thể cho trực tiếp vào mỏu: 0,5 ml mỏu cho 1 mg ureza.
- Trong dung dịch Nessler cú thuỷ ngõn và cỏc ion kim loại nặng khỏc, cú thể ức chế tỏc dụng của ureza. Vỡ vậy mà cỏc ống dựng ủể kiểm nghiệm phải hết sức sạch.
- Sau khi cho dung dịch Nessler vào, Nếu lọ vẫn ủục rất cú thể do nhiệt ủộ trong phũng quỏ cao gõy nờn. Cú thể khắc phục bằng cỏch trong bước hiện màu ngõm cỏc ống vào cốc nước lạnh, cho dung dịch Nessler vào hiện màu và so màu ngay.
mg% ủạm urờ x 2,143 = mg% ure
(Vỡ phõn tử lượng ure = 60, trong ủú cú 2 nguyờn tử Nitơ, từ ủú ta cú: 2,143 28
60
= )
- Nước cất dựng phải khụng cú Nitơ