3. ADN CR203 (-ARN) 4 ADN C71 (+ARN)
3.5.2 Sản xuất kháng thể
Sản phẩm protein CryIA(c) tái tổ hợp sau khi tinh chế và kiểm tra đã đợc chúng tôi sử dụng để gây miễn dịch sản xuất kháng thể kháng CryIA(c) dùng trong kiểm tra các cây chuyển gen. Đầu tiên, protein Cry đợc trộn với tá chất Freund toàn phần với tỉ lệ 1:1 (1ml dung dịch chứa khoảng 200 àg protein CryIA(c) tinh chế + 1ml tá chất Freund toàn phần) và tiêm dới da ở hai bên hông gần sống lng thỏ. Sau đó tiến hành tiêm nhắc lại vào các ngày thứ 5, 10 và 30. Đến ngày thứ 10 tính từ lần tiêm cuối cùng, chúng tôi đã tiến hành lấy máu thỏ và thu huyết thanh. Cần chú ý khi thu huyết thanh cần lấy máu ở động mạch, thao tác nhẹ nhàng tránh làm vỡ hồng cầu.
Để kiểm tra chất lợng kháng thể thu đợc, chúng tôi cũng đã tiến hành lai miễn dịch với 3 loại kháng nguyên: i) Kháng nguyên tái tổ hợp CryIA(c) do chúng tôi tinh chế; ii) Kháng nguyên CryIA(b) (nhận đợc từ TS. Nguyễn Thị Lộc); iii) Protein CryIA(c) (nhận đợc từ TS. Võ Thị Thứ – Viện Công nghệ Sinh học). Kết quả lai ở cả ba mẫu thí nghiệm trên (hình 3.30 - cột 1, 2, 3) đều xuất hiện một băng protein có kích thớc khoảng 68 kDa.
Chúng tôi cũng đồng thời tiến hành thí nghiệm kiểm tra chất lợng kháng nguyên CryIA(c) chúng tôi tinh chế đợc bằng cách lai miễn dịch với kháng thể chuẩn kháng CryIA(c) (do TS. Nguyễn Thị Lộc cung cấp). Sản phẩm lai (hình 3.30, cột 4) xuất hiện một băng có kích thớc khoảng 68 kDa. Kết quả dơng tính này một lần nữa khẳng định chúng tôi đã tinh chế đợc protein CryIA(c) tái tổ hợp.
Những kết quả trên cho thấy kháng thể chúng tôi sản xuất đợc có chất lợng tốt và có thể sử dụng để phân tích các cây trồng đợc chuyển gen cryIA(c). Nh vậy, những cây trồng đã chuyển gen cry ngoài việc đợc đánh giá sơ bộ bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), kỹ thuật lai miễn dịch protein của cây chuyển gen và kháng thể đặc hiệu cho protein Cry của loại gen đợc chuyển vào cây nhờ sử dụng kháng thể chúng tôi sản xuất đợc đã khẳng định ở bớc cao hơn, đó là khả năng biểu hiện gen chuyển thành sản phẩm protein có hoạt tính kháng sâu.
Hình 3.30. Lai miễn dịch các protein Cry tái tổ hợp với kháng thể kháng CryIA(c) và kháng thể chuẩn
1. Protein CryIA(c) (VCNSH) và kháng thể kháng CryIA(c) (VCNSH) 2. Protein CryIA(b) (VLĐBSCL) và kháng thể kháng CryIA(c) (VCNSH) 3. Protein CryIA(c) (TS. Võ Thị Thứ) và kháng thể kháng CryIA(c) (VCNSH) 4. Protein CryIA(c) (VCNSH) và kháng thể chuẩn (VLĐBSCL)