Một số loài thực vật có khả năng tự vệ trớc sự tấn công của côn trùng nhờ tạo ra protein là các chất ức chế tác động vào hệ tiêu hoá của côn trùng. Khai thác tính đặc hiệu của các protein này đã mở ra khả năng rất hấp dẫn trong chọn tạo giống cây trồng. Hiện nay, rất nhiều protein thực vật có độc tính ảnh hởng đến trao đổi chất của côn trùng đang là đối tợng quan tâm của các nhà công nghệ gen thực vật (bảng 1.1) [103], [178].
Bảng 1.1. Protein có hoạt tính diệt côn trùng và phổ hoạt động của chúng
Protein độc tố Côn trùng Tuyến trùng Nấm Động vật Bộ Cánh vảy Bộ Cánh cứng Bộ Cánh nửa Bộ Cánh thẳng Chất ức chế proteaza dạng serin + + - + + Chất ức chế proteaza dạng cystein - + - + - Lectin: Mannoza sp NacGlu sp + + + + + + + + - + Chất ức chế α -amylaza + + - +/ - Enzym: Lipoxygenaza Acyl-hydrolaza Chitinaza + + + + + + - + + - +
Protein bất hoạt hoá ribosom + + + + Protein tinh thể độc: CryI CryIII + - - + - - - - - - - -
● Các chất ức chế proteaza (Protease Inhibitor): là các proteaza ngoại bào dạng tự do hoặc gắn màng có khả năng ức chế quá trình tiêu hoá protein của côn trùng nhờ ngăn cản sự hoạt động của các proteaza - những enzym phân huỷ protein. Hầu hết chất ức chế proteaza của thực vật không gây ảnh hởng đến proteaza của bản thân chúng mà chỉ ức chế hoạt động proteaza của vi khuẩn và động vật. Rất có thể đây là cơ chế tự nhiên của thực vật nhằm bảo vệ mô tế bào khỏi bị tổn thơng do côn trùng gây hại và mầm bệnh tấn công. Các chất ức chế đối với proteaza dạng serin và cystein có rất nhiều trong hạt và các mô dự trữ của thực vật. Chúng có khả năng diệt nhiều loài sâu hại nh sâu ăn rễ ngô (Diabrotica spp.), tuyến trùng và một số loài sâu không chịu tác động của độc tố Bt [73], [165]. Một trong những chất ức chế proteaza dạng serin có giá trị đặc biệt là chất ức chế trypsin của cây đậu đũa (Trypsin Inhibitor from Cowpea). Chúng không độc đối với động vật và hoàn toàn không gây hại côn trùng có ích trong khi rất nhiều chất ức chế dạng serin gây độc ong mật (Apis mellifera) [138]. Các thử nghiệm sinh học cho thấy protein này đã kìm hãm sinh trởng và làm tăng tỷ lệ tử vong của sâu róm đục chồi thuốc lá (Heliothis virescens) cũng nh sâu xanh hại bắp ngô (Heliothis zea) [106]. Các dòng lúa chuyển gen mã hoá chất ức chế proteaza của cây đậu đũa và cây khoai tây có khả năng kháng côn trùng Bộ Cánh vảy rõ rệt [72], [203], dâu tây biểu hiện chất ức chế proteaza thể hiện hoạt tính kháng mọt hại nho [88]. Tuy nhiên, không phải tất cả chất ức chế proteaza đều có hoạt tính diệt côn trùng [84], [85]. Ngoài ra, khá nhiều bằng chứng cho thấy côn trùng có khả năng thích ứng với việc xuất hiện chất ức chế proteaza trong đờng tiêu hoá. Côn trùng Bộ Cánh vảy và Cánh cứng có thể tăng cờng biểu hiện các proteaza hoặc sản sinh enzym mới không mẫn cảm với chất ức chế proteaza và giảm những ảnh hởng có hại của chất ức chế proteaza trong hệ tiêu hoá của chúng. Nhằm tránh những khả năng thích ứng này, các loại chất ức chế proteaza có thể đợc biểu hiện đồng thời hoặc đợc cải tiến cho phù hợp với proteaza của côn trùng đích [85], [146].
● Các chất ức chế α - amylaza (α - Amylase Inhibitor - α-AI): nhằm vào quá trình chuyển hoá hydrat cacbon của sâu hại. Chúng có mặt trong hạt cây đậu chi
vật bao gồm chất ức chế α-amylaza, arcelin và phytohemagglutinin đều đợc mã hoá bởi một locut đơn trong genom và cùng bảo vệ hạt trớc sự tấn công của côn trùng gây hại nhng với phơng thức hoạt động hoàn toàn khác nhau [77]. Trong đó, chất ức chế α-amylaza thờng có tác dụng ức chế α-amylaza của côn trùng, bọ cánh cứng mà không ức chế α-amylaza của thực vật và vi sinh vật [148].
● Lectin: là nhóm protein rất đa dạng về cấu trúc và chức năng, đợc tìm thấy chủ
yếu ở thực vật. Chúng là nhóm protein liên kết đờng có chức năng bảo vệ cây trồng chống lại một số tác nhân nhất định, đặc biệt là côn trùng Bộ Cánh giống. Cơ chế thực vật tiết chất độc kháng côn trùng (và động vật bậc cao) vẫn cha rõ ràng. Tuy nhiên, hoạt tính của lectin phụ thuộc vào khả năng gắn với chuỗi bên hydrat cacbon trên glycoprotein, đặc biệt là các tế bào nằm trong thành ruột. Sự gắn kết này có thể gây ra những ảnh hởng đến mức độ thấm, sự sinh trởng, phát triển của thành ruột và sau đó ảnh hởng đến toàn bộ các cơ quan [85].
● Protein bất hoạt hoá ribosom (Ribosome Inactivating Protein): sản sinh bởi nhiều loài thực vật bậc cao. Dựa trên cấu trúc phân tử, protein này đợc phân loại thành hai nhóm: nhóm I với độc tính tơng đối thấp (gồm một chuỗi polypeptit A với phân tử lợng khoảng 23-32 kDa) và nhóm II rất độc (gồm chuỗi polypeptit A liên kết với chuỗi polypeptit B qua các cầu nối disulphit) [113]. Ngoài hoạt tính kháng nấm, trong một số trờng hợp protein bất hoạt hoá ribosom có hoạt tính kháng côn trùng, nh Ricin và saporin-S6 gây độc côn trùng Bộ Cánh cứng [35].
● Enzym: Rất nhiều enzym đã đợc quan tâm khai thác nhằm nâng cao tính kháng sâu bệnh của cây trồng. Cholesterol oxidaza là một họ protein diệt côn trùng mới có nguồn gốc từ các chủng xạ khuẩn Streptomyces với hoạt tính độc rất cao. Đây là nguồn nguyên liệu lý tởng để chuyển vào bông [160].
● Protein độc tố có nguồn gốc vi sinh vật: Ngoài protein tinh thể độc của Bt, một số vi sinh vật có khả năng tiết các protein độc tố diệt sâu hại. Bacillus cereus
sản sinh protein Vip1 và Vip2 gây độc sâu ăn rễ ngô. Một số chủng Bt sản sinh protein Vip3A gây độc sâu róm Agrotis và Spodoptera [75]. Ngoài ra, protein Cyt
(cytolytic) đợc tìm thấy ở các chủng Bt đặc hiệu côn trùng Bộ Hai cánh [53], [86]. Tuy nhiên, cho đến nay cha có những công bố về hoạt tính kháng sâu của các cây chuyển gen mã hoá các độc tố này.
● Protein độc tố có nguồn gốc từ động vật ăn thịt: Một số loài côn trùng ăn thịt nh nhện và bọ cạp sản sinh chuỗi peptit có hoạt tính gây độc thần kinh cực mạnh đối với côn trùng. Nguồn gen liên quan đến các peptit này đã đợc chuyển vào cây trồng. Tuy nhiên, nghiên cứu của Barton & Miller cho thấy độc tố của bọ cạp trong cây chuyển gen đồng thời gây độc nhiều loài côn trùng có ích [36].
● Chất trao đổi thứ cấp: Một số chất trao đổi thứ cấp nh alkaloit, cyanogenic glycosit, glucosinolat, saponin cũng có hoạt tính kháng sâu. Quá trình nghiên cứu chuyển các gen liên quan vào thực vật mới chỉ bắt đầu [91].
1.2.3.2 Thiết kế vectơ mang gen kháng côn trùng thế hệ mới
Vectơ thế hệ mới có thể tăng cờng khả năng biểu hiện của gen quan tâm, nâng cao chất lợng protein ngoại lai trong cây trồng. Thông thờng, các cải biến tập trung vào trình tự mang mã của gen quan tâm, đoạn khởi động, trình tự tăng cờng, intron...