Chơng 2 vật liệu và phơng pháp
2.2.2.1 Tách chiết ADN plasmit của vi khuẩn E coli và A tumefaciens
Tế bào vi khuẩn đợc nuôi cấy và nhân lên đến giai đoạn giữa pha log. Thành tế bào đợc phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy mạnh có trong dung dịch I và dung dịch II. ADN nhiễm sắc thể và protein trong tế bào đợc loại ra nhờ dung dịch III và phenol, chloroform, isoamylalcohol. ADN plasmit đợc kết tủa bằng ethanol và thu lại nhờ ly tâm với tốc độ 14000 v/ p. ADN đợc hòa trong TE (Tris.Cl + EDTA) và tiến hành loại ARN. Hoá chất tách chiết ADN plasmit bao gồm: (1) Dung dịch I: 50 mM glucoza; 25 mM Tris.Cl pH 8,0; 10 mM EDTA pH 8,0. Khử trùng, giữ ở - 40C; (2) Dung dịch II: 0,2 N NaOH; 1% SDS (Sodium dodecyl sulfate). Pha mới trớc khi
sử dụng; (3) Dung dịch III: 60 ml axetat K 5 M; 11,5 ml axit axetic; 28,5 ml H2O; (4) Dung môi loại protein: phenol; hỗn hợp phenol : chloroform : isoamylalcohol (25: 24:1); chloroform : isoamylalcohol (24:1); (5) 0,01M TE pH 8,0: 0,1 mM Tris.Cl pH 8,0; 0,01 mM EDTA pH 8,0.
● Quy trình tách chiết ADN plasmit của E. coli: (1) Nuôi cấy lắc qua đêm tế bào E. coli trong 3 ml môi trờng LB với kháng sinh thích hợp ở 370C, 200 v/ p; (2) Ly tâm 1,5 ml dịch nuôi cấy trên ở 6000 v/ p, 8 phút; (3) Hoà cặn tế bào vi khuẩn trong 100 àl dung dịch I để lạnh, giữ trong đá 5 phút; (4) Bổ sung 200 àl dung dịch II pha mới, đảo đầu ống eppendorf nhẹ nhàng và giữ trên đá 10 phút; (5) Thêm 150
àl dung dịch III để lạnh, đảo nhẹ và ủ trong đá từ 3-5 phút; (6) Thêm 550 àl phenol : chloroform, đảo đầu ống eppendorf và ly tâm ở 14000 v/ p, 15 phút; Hút dịch pha trên sang ống eppendorf mới và chiết tiếp bằng chloroform : isoamylalcohol; (7) Bổ sung 1 ml cồn tuyệt đối và 10 àl 3M axetat Na, để lạnh -200C trong 3 giờ và ly tâm 14000 v/ p, 8 phút thu ADN; (8) Rửa cặn bằng 0,2 ml cồn 70%, ly tâm 14000 v/p, 3 phút, làm khô và hoà cặn trong 40 àl 0,01 M TE, giữ ở -20 0C; (9) Bổ sung RNaza vào mẫu ADN đến nồng độ cuối cùng là 100 μg/ ml,ủ mẫu ở 370C trong 1 giờ, chiết bằng phenol : chloroform, chloroform : isoamylalcohol và tủa lại ADN bằng ethanol; (10) nồng độ và độ sạch của ADN đợc xác định bằng phổ hấp thụ trên máy quang phổ tử ngoại và điện di trên gel agaroza 0,8% [170].
● Tách chiết ADN plasmit của A. tumefaciens: (1) Nuôi cấy lắc tế bào ở 280C, 36 giờ trên môi trờng YEP có bổ sung kháng sinh; (2) Ly tâm 1,5 ml dịch nuôi cấy trên ở 12000 v/ p trong 10 phút, hoà cặn tế bào nhẹ nhàng trong 1 ml dung dịch rửa pH 8,0 (0,5 M NaCl; 50 mM Tris.Cl; 20 mM EDTA; 0,1 % sarcosyl), sau đó ly tâm ở 12000 v/ p, 40C, trong 1 phút; (3) Hoà cặn trong 100 μl dung dịch GTE (50 mM glucoza; 25 mM Tris.Cl; 10 mM EDTA pH 8,0), thêm 25 μl lysozym 40 mg/ ml pha trong GTE, trộn đều và ủ ở 370C trong 15 phút; (4) Bổ sung 200 μl dung dịch II pha mới, đảo nhẹ đầu ống eppendorf, ủ 10 phút ở 370C. Nếu mẫu không trong, ủ ở 500C, 5 phút; (5) Bổ sung 150 μl dung dịch 3M axetat Na pH 5,2; lắc, giữ 10 phút ở nhiệt độ phòng; (6) Ly tâm ở 12000 v/ p trong 5 phút, chuyển dịch pha
trên sang eppendorf mới, bổ sung 550 μl phenol : chloroform, ly tâm 15 phút và tiếp tục chuyển pha trên sang eppendorf mới. Bổ sung 1 ml cồn tuyệt đối và giữ ở -200C trong 1-2 giờ; (7) Ly tâm ở 12000 v/ p trong 5 phút để thu ADN/ ARN, rửa cặn bằng cồn 70% và hoà cặn trong 50 μl TE [197].