3. ADN CR203 (-ARN) 4 ADN C71 (+ARN)
3.5 Lai miễn dịch và sản xuất kháng thể kháng CryIA(c) 1 Lai miễn dịch
3.5.1 Lai miễn dịch
Rất nhiều chủng Bt tự nhiên đã đợc xác định chứa nhiều protein tinh thể độc tố nhờ phơng pháp lai miễn dịch với kháng thể đa dòng. Để khẳng định chính xác băng protein mới xuất hiện là CryIA(c), chúng tôi đã tiến hành làm phản ứng lai miễn dịch sử dụng kháng thể kháng CryIA(c) chuẩn do GS. Supat, Thái Lan cung cấp.
Kết quả lai dơng tính trên hình 3.29 cho thấy, gen cải biến cryIA(c) đã đợc biểu hiện mạnh ở E. coli chủng BL21 (DE3) với hệ vectơ pET21d, protein tái tổ hợp khá ổn định và không bị phân huỷ. Băng protein chính xuất hiện trên cột 3 có kích thớc phân tử phù hợp với kích thớc phân tử của CryIA(c) theo tính toán lý thuyết. Đặc biệt, CryIA(c) tái tổ hợp sau khi tinh chế đã lai rất đặc hiệu với kháng thể là
Hình 3.28. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện gen cryIA(c) và tinh chế protein CryIA(c) tái tổ hợp
1. Chỉ thị phân tử chuẩn
2. Protein tổng số của E. coli (đối chứng)
3. Protein tổng số chủng E. coli mang gen cryIA(c) 4. Cặn tế bào sau khi xử lý bằng lysozym
5. Dịch nổi tế bào sau khi xử lý bằng lysozym 6. Protein CryIA(c) tái tổ hợp sau khi tinh chế
protein tái tổ hợp chúng tôi sử dụng để phát hiện CryIA(c). Sản phẩm lai chỉ xuất hiện một băng duy nhất (cột 2).
Việc biểu hiện thành công gen cry trong E. coli có một ý nghĩa vô cùng quan trọng. Đặc biệt khi vectơ Ti-plasmit mang kết cấu gen Ubi-cryIA(c) do chúng tôi thiết kế đã và đang đợc chuyển vào lúa và các loại cây trồng khác. Ngoài ra, các nghiên cứu chuyển gen cry trên đối tợng cây ngô đã đợc triển khai trong chơng trình hợp tác với Viện Nghiên cứu Ngô. Phơng pháp phát hiện protein tinh thể độc tố trong các cây lúa, ngô chuyển gen … cry cần phải có kháng thể (sản xuất trên cơ sở protein Cry tái tổ hợp). Nh vậy, protein Cry tái tổ hợp sẽ đợc sử dụng để kiểm tra các cây trồng chuyển gen này. Hơn nữa, Cry tái tổ hợp cũng có thể dùng trong mô hình thử nghiệm ở quy mô phòng thí nghiệm nghiên cứu tác động của protein tinh
Hình 3.29. Lai miễn dịch protein CryIA(c) tái tổ hợp với kháng thể kháng CryIA(c)
1. Chỉ thị phân tử chuẩn
2. Lai miễn dịch protein CryIA(c) tái tổ hợp sau khi tinh chế 3. Lai miễn dịch protein tổng số của E. coli mang gen cryIA(c)
thể độc tố lên các loài côn trùng khác nhau. Qua kết quả lai miễn dịch này, có thể khẳng định chúng tôi đã thành công trong việc biểu hiện gen cryIA(c) ở vi khuẩn E. coli.